MỤC LỤC
Qua thời gian nghiên cứu, với những thành công trong lĩnh vực sinh học phân tử ở nước ta, việc nghiên cứu chế tạo ra một loại vacxin tái tổ hợp với độ an toàn và hiệu quả là điều có thể thực hiện. Ngoài ra, khi nội độc tố được giải phóng, nó kích thích đại thực bào và các tế bào viêm khác để sản xuất ra các cytokin như TNF, IL-1,IL-6 và các chất gây viêm khác, làm tăng phản ứng viêm cấp [28]. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng kháng nguyên H có khả năng gây đáp ứng miễn dịch mạnh, đặc biệt có khả năng tạo miễn dịch nhớ, miễn dịch bảo hộ giúp gia cầm chống lại Salmonella.
Bình thường kháng nguyên roi ở pha fliC hoạt động tương đối mạnh trong các cơ thể gia cầm và gây ra nhiều bệnh cho gia cầm, nhiều nhất là bệnh về đường ruột, từ đó lây lan sang người qua đường ăn uống và hô hấp.
Tuy nhiên khi cơ thể có kháng thể chống lại flic thì vi khuẩn chuyển sang biểu hiện gen fljB để tạo roi giúp vi khuẩn di động, bám dính vào niêm mạc ruột, xâm nhiễm vào cơ thể. James Phipps, một cậu bé tám tuổi sống tại làng quê nước Anh đã được bác sĩ Edward Jenner tiêm chủng để chống lại được dịch bệnh đậu mùa đang lây lan rộng khắp [65]. Tuy nhiên, phải đến gần một thế kỷ sau, Luis Pasteur (1879- 1881) mới chế tạo thành công 3 loại vacxin giảm độc lực (attenuated vaccine) chống bệnh lỵ ở gà, bệnh than và bệnh dại, ông đã áp dụng thành công khi thử nghiệm phương pháp điều trị bệnh dại trên cơ thể người: bé Josehp Meister đã được cứu sống.
Việc gây miễn dịch chủ động (tiêm chủng phòng bệnh) đã được hiểu biết một cách đầy đủ hơn và luôn là lựa chọn hàng đầu, trong cuộc sống chống lại các bệnh dịch do các vi sinh vật gây nên.
Trong các loại vacxin trên mặc dù có một số khó khăn trong quá trình lựa chọn kháng nguyên, tách dòng và biểu hiện nhưng dạng vacxin sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp vẫn là dạng vacxin có độ an toàn cao, dễ sử dụng, dễ bảo quản và cho giá thành rẻ [43, 60]. Nhờ cơ chế trình diện kháng nguyên của đại thực bào cùng với phân tử MHC II (hệ thống gen kiểm soát đáp ứng miễn dịch nằm trong hệ phù hợp tổ chức chính) giúp tạo ra dòng tế bào lympho B có khả năng tiết IgG đặc hiệu với kháng nguyên vi khuẩn. Tương tự như các vacxin vi khuẩn, vacxin chống ký sinh trùng cũng có những đặc điểm như khả năng tạo miễn dịch lâu dài bảo vệ cơ thể chủ, khả năng an toàn… Tuy nhiên, đối với việc sản xuất vacxin ký sinh trùng, có rất nhiều khó khăn nảy sinh.
Vacxin tái tổ hợp có thể khắc phục được những khiếm khuyết do quá trình tinh chế có thể gây ra nhưng sự biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp lại gặp khó khăn trong quá trình lựa chọn kháng nguyên để biểu hiện và sự hình thành đúng cấu trúc kháng nguyên sau khi biểu hiện.
Có hai cách chủ yếu được sử dụng để phân lập gen là: phân lập gen từ thư viện gen trong trường hợp gen quan tâm chưa biết trình tự và phân lập bằng kĩ thuật PCR khi đã biết trình tự của gen quan tâm. Đặc trưng trong cấu trúc hệ gen của sinh vật nhân sơ gồm các gen mã hoá liên tục không phân đoạn, còn ở sinh vật nhân chuẩn gen cấu trúc là những vùng mã hoá (exon) nằm xen kẽ với vùng không mã hoá (intron). Do đó để phân lập từ sinh vật nhân sơ hay sinh vật nhân chuẩn người ta phải sử dụng các phương pháp khác nhau để tạo ngân hàng gen [4, 21].
Với sinh vật nhân sơ thì nguyên tắc chung của lập ngân hàng gen là ADN hệ gen được cắt bằng enzim hạn chế để tạo ra các đoạn có kích thước nhỏ và sau đó các đoạn nhỏ này đưa vào vector. Các vector mang các dòng gen ADN đích được nhận biết, tách chiết và xác định trình tự cũng như đặc điểm của chúng. Còn với sinh vật nhân chuẩn: Nếu gen phân lập là gen được điều khiển sử biểu hiện thì quá trình tạo ngân hàng gen được tiến hành tương tự như đối với sinh vật nhân sơ, nếu gen quan tâm là gen cấu trúc thì phải thông qua mARN để tạo ngân hàng cDNA.
Sau khi có ngân hàng gen, quá trình phân lập có thể được tiến hành theo nhiều cách khác nhau như: Lai ADN, phân tích miễn dịch, phân tích hoạt động của enzim…. Đối với các gen mà đã biết trình tự của gen trong cùng nhóm và được phân lập từ cùng một nguồn sinh vật thì việc phân lập gen trở nên đơn giản hơn rất nhiều. Bằng kỹ thuật PCR, đoạn gen cần phân lập nằm trong trình tự đích được nhân lên một cách chính xác và thu được một số bản sao lớn với độ thuần khiết cao và dễ dàng được đưa vào vector tách dòng, phục vụ cho bước tiếp theo [1].
Gen ngoại lai được điều khiển bởi promoter T7- đây là promotor mạnh và có tính đặc hiệu cao, có khả năng biểu hiện protein ngoại lai lớn chiếm 10- 30% tổng số protein tế bào, có độ nhạy cao với các chất cảm ứng nên có thể điều khiển dễ dàng sự biểu hiện của gen ngoại lai. Thioredoxin góp phần làm tăng khả năng biểu hiện của gen ngoại lai khi dung hợp với nó. Ngoài ra vị trí cắt của enterokinaza được thiết kế trước vùng đa điểm cắt để tách protein tái tổ hợp ra khỏi Thioredoxin [1].
Tất cả các ưu điểm trên cho thấy pET-32a(+) không chỉ thiết kế riêng cho việc biểu hiện gen ngoại lai mà còn thuận lợi cho việc tinh sạch trong quá trình thu nhận protein tái tổ hợp. Do đó chúng tôi đã lựa chọn vector này để biểu hiện cho protein tái tổ hợp của gen ngoại lai fljB mã hoá cho kháng nguyên roi H: 1,2 của vi khuẩn S. Trong quá trình biểu hiện protein ngoại lai, người ta thường gặp phải một số vấn đề về chủng biểu hiện đó là: các protein sau khi được biểu hiện bị các protease nội bào phân giải.
Để bảo vệ protein ngoại lai người ta sử dụng đoạn peptit tín hiệu để đưa các protein này ra ngoài khoang chu chất, tuy nhiên không phải lúc nào cũng thực hiện được. Do vậy, hiện nay người ta sử dụng biện pháp phổ biến là tạo các chủng biểu hiện mang các gen đột biến làm mất khả năng tổng hợp các protease.
Protein có khối lượng lớn còn lại sau khi xử lý với enzym được loại bỏ bằng cách ly tâm, protein nhỏ hoà tan vào dung dịch phenol/chloroform/isoamylalcohol nằm ở pha dưới. Trên cơ sở đoạn ADN khuôn, quá trình tổng hợp ADN diễn ra nhờ phản ứng cấp bậc trước làm tiền đề cho phản ứng cấp bậc sau với cường độ tăng trưởng theo cấp số nhân dưới sự xúc tác của enzim ADN polimeraza. Quá trình tinh sạch ADN từ gel agaroza bằng cột QUIAGEN Hiện nay, để tinh sạch ADN, các phòng thí nghiệm sinh học phân tử thường sử dụng bộ kít riêng.
Các nucleotide nằm ở đầu dính của một sợi ADN đơn có khả năng hình thành cầu nối hydro với các nucleotide bổ sung nằm trên đầu dính của đoạn ADN khác. Kết quả là một liên kết este hình thành giữa gốc phosphat đầu 5’ của đoạn DNA này với gốc hidroxyl đầu 3’ của đoạn kia đồng thời giải phóng ra một phân tử nước. Dưới tác dụng của CaCl2, thành tế bào đang ở thời kỳ sinh trưởng trở nên xốp, tạo điều kiện cho ADN plasmit có thể chui qua các lỗ trên màng tế bào vào tế bào chất khi thay đổi nhiệt độ đột ngột.
-Hút nhẹ nhàng pha trên khoảng 400 ỡl sang ống eppendorf mới, bổ sung thờm 400 àl dung dịch hỗn hợp cholorofom: isoamylalcohol, ly tõm 14000 vòng/phút trong 10 phút và tiếp tục hút nhẹ nhàng ở pha trên. - Sau khi chạy điện di xong lấy nhẹ bản gel ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 0,5 àg/ml trong khoảng 15 phỳt rồi được rửa lại bằng nước. - Xử lý mẫu protein: Sau khi nuôi cấy ở điều kiện cảm ứng bằng IPTG, các tế bào thu lại nhờ ly tâm được phá bằng đệm xử lý mẫu treatment buffer 6X và biến tính ở 100oC trong 10 phút để phá tế bào.
- Gỡ bản gel ra và nhuộm bằng Cosmasie brilliant blue trong một giờ, sau đó rửa lại bằng dung dịch tẩy rữa cho đến khi quan sát được các băng protein. - Thu mẫu: thu theo phân đoạn mỗi phân đoạn 2 ml bắt đầu từ khi bổ sung đệm đẩy mẫu Imidazol 500 mM được 10 phân đoạn thì dừng lại.