Nghiên cứu khả năng sinh Aspergillus niger pectinmethylesterase trên cơ chất bã táo

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

• GIỚI THIỆU PECTIN METHYLESTERASE
• PECTIN
• QUÁ TRÌNH TRÍCH LY ENZYME PME TỪ NẤM MỐC A. NIGER TRÊN CƠ CHẤT BÃ TÁO

Phối hợp với các enzyme pectinase khác, PME có trách nhiệm trong việc điều khiển sự thoái hóa của pectin và sự mềm đi của mô thực vật trong quá trình chín và là enzyme đầu tiên tác dụng lên pectin trên vách tế bào. Các PME ở thực vật tấn công vào đầu không khử hoặc gần với nhóm carboxyl tự do và tiến dọc theo phân tử bằng cơ chế chuỗi đơn, tạo ra các khối galacturonic acid không bị ester hóa rất mẫn cảm với calcium (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004). Các chất có phân tử lƣợng thấp khác nhƣ polyol (glycerol, glucose, maltose) có khả năng ức chế hoạt động của PME chuối (Brady, 1976; trích dẫn bởi Sajjaanantakul and Pitifer, 1991).

­ Những chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử proenzyme làm loại bỏ một vài đoạn peptid, tạo điều kiện cho các nhóm chức xích lại gần nhau để hình thành trung tâm hoạt động. Các chế phẩm enzyme sử dụng trong sản xuất nước quả có tác dụng làm trong dịch chiết ép (nhất là đối với những quả có nhiều pectin, độ nhớt cao) tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình cô đặc dịch quả, làm tăng hiệu suất ép, hiệu suất trích ly các chất trong tế bào thực vật. Ảnh hưởng của sự demethoxyl pectin đối với độ cứng mô thực vật bao gồm hai hiện tƣợng: ở mô chƣa xử lý, sự hiện diện các nhóm carboxyl tự do làm tăng khả năng tạo thành và độ bền của phức calci giữa hai mạch pectin, và ở mô đã xử lý nhiệt sẽ có sự gia tăng liên kết với ion Ca2+ và làm giảm nguy cơ bị tự phân cắt hay còn gọi là β–elimination (Sajjaanatukal and Van Buren, 1989).

Kỹ thuật trong trong chân không (vacuum infusion–VI) đƣợc sử dụng trong nhiều quá trình chế biến khác nhau để cải thiện chất lƣợng về cấu trúc của sản phẩm hoặc tạo sự đồng nhất của các thành phần chức năng trong sản phẩm. Trong lĩnh vực chăn nuôi, người ta cho thêm chế phẩm pectinase vào thức ăn có chứa nhiều cellulose để làm tăng quá trình hấp thu thức ăn của gia súc, vì nó góp phần vào việc thủy phân chất pectin, cellulose có trong thức ăn. Tỏo cũng giống nhƣ nhiều loại quả khỏc cú rất nhiều pectin đặc biệt là phớa trong lừi (Joshi, 2006), nên đƣợc chọn làm cơ chất để nuôi cấy nấm mốc sinh tổng hợp PME.

Các enzyme này thường được sử dụng trong sản xuất các loại nước quả trong như nước táo, lê, nho,… và một lượng nhỏ sử dụng trong chế biến các dạng nước quả có độ đục ổn định như nước chanh, nước mận. Tuy nhiên, các enzyme này thường ở dạng hỗn hợp, gây khó khăn cho việc ứng dụng chúng để tác động nhƣ các loại pectin công nghiệp, nhƣ trong các loại gel thực phẩm. Quá trình nuôi cấy nấm mốc Aspergillus niger sản xuất enzyme PME có thể đƣợc thực hiện theo cả hai phương pháp nuôi cấy bề mặt với môi trường rắn và lên men chìm.

Muối trung tính như amonium sulfate, natri chloride thường được sử dụng để kết tủa enzyme vì độ hoà tan của muối rất cao, sự kết tủa không phụ thuộc vào nhiệt độ, không làm biến tính enzyme, enzyme thu đƣợc có hoạt tính cao hơn so với các enzyme thu được bằng phương pháp sử dụng dung môi hữu cơ. Theo Nguyễn Đức Lƣợng (2004) trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu tối thích của môi trường là 58 ÷ 60% và phải giữ cho độ ẩm của môi trường ổn định trong quá trình nuôi. Với thành phần pectin trong ha ̣t hướng dương là 21,36%, Patil và Dayanand (2006) đã xác nhận tính khả thi của việc sử dụng hạt hướng dương trong sản xuất PME từ Aspergillus niger cho cả hai trường hợp lên men rắn và lên men chìm.

PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM

Tỉ lệ bột tỏo và nước cho enzyme PME cú hoạt tớnh cao nhất sẽ đƣợc chọn sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Độ ẩm môi trường và hoạt tính của PME (U/mL) tương ứng với từng nghiê ̣m thức thí nghiệm. Xác định thời gian ủ thích hợp cho nấm mốc phát triển sinh tổng hợp PME đạt hiệu suất và hoạt tính cao nhất.

Làm mát các bình này sau khi thanh trùng, kế đến cho 2 mL huyền phù bào tử (103 cfu/mL) vào mỗi bình. Xác định điều kiện môi trường nuôi cấy thích hợp cho sự sinh tổng hợp pectinmethylesterase là tốt nhất. Sau khi làm mát và cấy 2 mL huyền phù bào tử (103 cfu/mL), các bình đƣợc ủ ở nhiệt độ phòng và thời gian tối thích ở thí nghiệm trên.

Giá trị pH của dung dịch đệm cho hoạt tính PME cao nhất đƣợc chọn làm nhân tố cố định cho các thí nghiệm sau. Tìm ra tỉ lệ amonium sulfate bổ sung thích hợp nhất cho khả năng tổng hợp PME từ nấm mốc A.niger. Cho vào mỗi bình nón 5 g bột bã táo, pha loãng theo tỉ lệ tối thích ở thí nghiệm 1 với dung dịch đệm citrate có pH tối thích ở thí nghiệm trên, và bổ sung amonium sulfate theo các tỉ lệ khảo sát, đem thanh trùng ở 121oC trong 15 phút.

KẾT QUẢ THẢO LUẬN

Bên cạnh ảnh hưởng của độ ẩm môi trường lên men, các yếu tố khác như thời gian ủ, pH hay thành phần dƣỡng chất thích hợp cho hiệu quả sinh enzyme hoạt tính cao cũng cần đƣợc quan tâm. Trong nghiên cứu này, mật số nấm mốc vẫn được cố định (103 cfu/mL), tỉ lệ pha loãng của bã táo và nước là 1: 3 để tiến hành khảo sát sự thay đổi hoạt tính PME sinh ra theo thời gian ủ ở nhiệt độ phòng. Vì sau giai đoạn tăng trưởng nấm mốc sẽ chuyển sang giai đọan suy vong, số bào tử chết đi nhiều hơn số bào tử mới hình thành trong điều kiện cơ chất đã cạn kiệt nên không thể tăng trưởng được nữa (Lê Xuân Phương, 2007).

Tóm lại, thời gian 96 giờ là thích hợp nhất để thu chế phẩm enzyme, đây cũng là thời gian ủ tối ưu tương đồng với nghiên cứu của Joshi (2006) trên cơ chất bã táo cũng nhƣ khảo sát của Patil và Dayanand (2006) khi khảo sát khả năng sinh PME từ A.niger với cơ chất là dầu hạt hướng dương. Điều kiện pH của môi trường cũng là một trong những nhân tố ảnh hưởng đến khả năng sinh PME của nấm mốc, ở giá trị pH thích hợp nấm mốc sẽ phát triển và gia tăng mật số nhanh chóng nên sinh tổng hợp đƣợc PME có hoạt tính cao hơn. Vì nấm mốc thích hợp trong môi trường acid yếu (Lê Xuân Phương, 2007) nên thí nghiệm được tiến hành để nghiên cứu ảnh hưởng của việc thay đổi pH môi trường (ở các mức thay đổi 3,5; 4,0; 4,5 và 5,0) đến khả năng sinh PME từ Aspergillus niger.

Trong nghiên cứu này, mật số nấm mốc vẫn đƣợc cố định (103 cfu/mL), để ủ trong 96 giờ ở nhiệt độ phòng, tiến hành khảo sát sự thay đổi hoạt tính PME sinh ra theo pH của môi trường. PME thu được khi lên men ở điều kiện pH môi trường bằng 4,5 có hoạt tính không khác biệt ý nghĩa so với mẫu có pH = 4,8 (mẫu đối chứng) nhƣng lại có hoạt tính cao hơn mẫu có pH = 5. Ở giá trị pH trong khoảng 4,5 ÷ 5,0, tuy sự hình thành bào tử và giai đoạn tăng trưởng của nấm mốc không bị ảnh hưởng nhưng sự tạo thành enzyme bị kìm hãm (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004) nên enzyme đƣợc tạo thành có hoạt tính không cao.

Nghiên cứu của Sun Zhong-Tao (2008) trên cơ chất bã táo cũng cho thấy pH môi trường bằng 4,0 là thông số tối ưu cho việc sinh tổng hợp các enzyme pectinase của nấm mốc A. Trong thí nghiệm này, mật số nấm mốc vẫn đƣợc cố định (103 cfu/mL), cố định pH môi trường là 4,0 để ủ trong 96 giờ ở nhiệt độ phòng để tiến hành khảo sát sự thay đổi hoạt tính PME sinh ra theo tỉ lệ (NH4)2SO4 được bổ sung vào trong môi trường nuôi cấy. Ở tỉ lệ bổ sung 0,1% không khác biệt ý nghĩa so với mẫu không bổ sung (NH4)2SO4, có thể do tỉ lệ bổ sung quá ít nên nấm mốc không sử dụng đƣợc nhiều do đó sự gia tăng mật số không khác biệt so với mẫu không bổ sung.

Trong khi đó, với tỉ lệ (NH4)2SO4 bổ sung là 0,3%, do hàm lƣợng nitơ khá cao, nấm mốc sử dụng nitơ để gia tăng mật số và phát triển nhanh chóng, nên ít sử dụng thành phần dinh dưỡng của môi trường, nên mặc dù nấm mốc phát triển nhanh chóng nhƣng chƣa tổng hợp đƣợc enzyme thì đã chuyển sang giai đoạn tử vong.