Ứng dụng công nghệ sinh học phân tử trong phòng trừ bệnh nấm Phytophthora capsici gây bệnh đốm vằn trên ớt

Sử dụng phản ứng PCR để phát hiện vi khuẩn Pseudomonas fluorescense định cƣ trong đất và trong vùng rễ cây trồng

Trong khoá luận này, hai cặp primer đặc hiệu được sử dụng để phát hiện Pseudomonas fluorescens là phl - 2a, phl - 2b và B2BF, BRR4 được thiết kế dựa trên trình tự của gen phlD có vai trò trong việc tổng hợp chất 2,4 – DAPG (2,4 - Diacetylphloroglucinol). Đây là một chất kháng sinh sinh học, giúp cây trồng kháng với một số nấm bệnh.

Phương pháp tinh sạch DNA bằng cột GFX (Amersham)

Đối với sản phẩm PCR những thành phần còn dư như primer hay dNTP có thể được loại bỏ hoàn toàn sau khi tinh sạch. - Biến tính protein: “Capture buffer” có tác dụng biến tính protein và tăng cường khả năng liên kết chuỗi DNA với cột GFX. - Rửa: DNA được rửa bằng dung dịch rửa để loại bỏ muối và các thành phần khác - Hòa tan DNA: DNA tinh sạch được hòa tan trong TE.

Sau đó, cho dung dịch DNA cần tinh sạch vào cột GFX chứa capture buffer. Dùng dao cắt gel chứa band DNA cần được tinh sạch, cho vào eppendorf 1,5 ml. Dựng micropipette hỳt capture buffer theo mg / v (10 mg gel ≈ 10 àl capture buffer), đậy nắp eppendorf, vortex nhẹ, ủ ở 60oC cho đến khi agarose tan hết.

Tác nhân đánh dấu

Muốn tạo ra thể hạt helide có bạc, mang tính chất có thể phát triển được trên phim, người ta phải làm thế nào để năng lượng tỏa ra sẽ được những hạt helide này hấp thụ, tạo nên hiệu ứng electron. Chemiluminescence: Ở phương pháp này người ta dùng hóa chất để tạo sự gắn kết với probe và cách thức phát hiện dựa vào ánh sáng phát ra từ luminol. Hệ thống phát hiện và đánh dấu không dùng phóng xạ bao gồm các hệ thống có thuật ngữ chuyên môn là “horseradish peroxidase”, “digoxigenin - antidigoxigenin”, và “biotin – streptavidin”.

Glutaraldehyde là một hoá chất có tính chất liên kết chéo với hai chức năng, mà sự liên kết chéo (crosslink) đồng hoá trị như vậy sẽ làm cho marker enzym HRP tương tác với DNA probe. Hệ thống digoxigenin-antidigoxigenin hoạt động trên cơ sở sử dụng digoxigenin (DIG), một cardenolide steroid được phân lập từ cây Digistalis (Martin và ctv, 1990). Một dạng đồng phân của nucleotide triphosphate được gài vào phân tử DNA nhờ phản ứng giải mã có thuật ngữ “nick translation”, hoặc nhờ đánh dấu primer ngẫu nhiên.

Thể probe được đánh dấu DIG này, có thể được phát hiện nhờ một xét nghiệm tính miễn dịch có liên kết với một enzyme, sử dụng trong kháng thể đối với digoxigenin (anti - DIG). Phản ứng kết gắn avidin – biotin tạo ra một vật chất có khối lượng lớn, bởi vì điểm đẳng điện của avidin mạnh hơn tương tác có tính tĩnh điện, và carbohydrate của avidin có xu hướng gắn với lectin như những protein. Streptavidin, giống như avidin, có tính chất kết gắn với biotin rất mạnh mẽ, nhưng không phát sinh ra vấn đề do vật chất có khối lượng lớn như avidin.

Phương pháp đánh dấu

(c) Sau đó đoạn Klenow của DNA polymerase I có thể tổng hợp một bản sao của sợi khuôn từ đoạn mồi, khi nó đính các [α32P] để tạo ra một phân tử đánh dấu. Dùng cho hệ thống đánh dấu phóng xạ, trong kỹ thuật này enzyme polynucleotide kinase được sử dụng để chuyển nhóm phosphate nằm ở cuối ATP sang đầu 5’- hydroxyl của các phân tử nucleic acid. Nếu như ATP được đánh dấu phóng xạ, thì nó sẽ sản sinh ra nucleic acid được đánh dấu với hoạt tính đặc hiệu tương đối thấp, bởi vì chỉ có đuôi của mỗi phân tử được đánh dấu phóng xạ (Kurt Weising và ctv, 1995;.

Khi photobiotin phỏt quang với ỏnh sỏng thấy được rất rừ, sự hiện diện của nucleotide đã được đánh dấu (Bùi Chí Bửu vá Nguyễn Thị Lang, 2000). Vật liệu trong đánh dấu photobiotin bền hơn và rẻ hơn so với phản Hình 2.12 Đánh dấu “end labelling” dùng enzym polynucleotide kinase (PNK) (a) DNA được dephosphoryl hóa bằng phosphatase, để tạo các nhóm 5’- OH. Đây là một phương pháp nên được áp dụng trong trường hợp sử dụng một số lượng lớn thể probe mà không cần phải quá nhạy cảm (Karcher, 1996).

Men này có thể liên kết trực tiếp với phân tử DNA, hay nó đóng vai trò như một probe, hoặc liên kết đồng hóa trị với streptavidin, rồi sau đó gắn với thể probe có đánh dấu biotin. Men alkaline phosphatase có thể liên kết đồng hóa trị với một kháng thể nào đó, mà kháng thể này đối nghịch với hapten, thí dụ như digogenin. Giai đoạn 2: những thành phần khác trong phản ứng sẽ kích thích cường độ tín hiệu, đặc biệt là sự có mặt của đại phân tử bovine serum albumin (BSA), hoặc sự hình thành “micelles” ngậm nước như cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB), nó làm kích thích cường độ tín hiệu, và chuyển dịch độ dài sóng ánh sáng được truyền đi.

Cơ sở của sự lai phân tử

Đoạn DNA càng dài bao nhiêu thì số lượng liên kết hydro nối hai mạch càng lớn bấy nhiêu và do đó nhiệt độ nóng chảy cũng càng cao. Những điểm bắt cặp sai lệch (A bắt cặp với C, G bắt cặp với T,…) sẽ làm giảm tính ổn định của phân tử lai. Sau khi hai mạch của phân tử DNA tách rời nhau dưới tác động của Tm, sự bắt cặp trở lại sẽ không xảy ra nếu nhiệt độ phản ứng hạ xuống đột ngột; lúc đó phân tử DNA sẽ tồn tại trong môi trường ở dạng mạch đơn dưới một cấu hình không gian vô trật tự.

Ngược lại, nếu sau khi hai mạch tách rời, nhiệt độ được làm giảm từ từ cộng với điều kiện thí nghiệm thích hợp, hai mạch sẽ bắt cặp trở lại. Đặc hiệu tuyệt đối: Sự tái bắt cặp chỉ xảy ra giữa hai trình tự hoàn toàn bổ sung dẫu chúng chỉ có hai bản sao nằm lẫn giữa hàng triệu trình tự khác. Các trình tự bổ sung có thể là DNA hay RNA, dẫn đến sự hình thành các phân tử DNA-DNA, RNA-RNA, hay các phân tử lai DNA-RNA.

Để sự bắt cặp giữa hai mạch đơn xảy ra, các trình tự bổ sung phải tiến đến gần và ở vị trí đối diện nhau. Nồng độ DNA, nghĩa là số lượng các trình tự bổ sung, càng cao thì xác suất chúng tiếp xúc với nhau càng tăng; kết quả là phản ứng lai phân tử tăng lên. Tương tự, thời gian phản ứng càng dài thì xác suất nói trên càng lớn hơn và số lượng phân tử lai tăng dần cho đến khi toàn bộ các trình tự bổ sung đều tái bắt cặp.