So sánh hiệu quả thụ tinh trong ống nghiệm trên chó sử dụng môi trường TYH và Fert-TALP

Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ β-mercaptoethanol sử dụng để nuôi chín trứng β-mercaptoethanol có vai trò cải thiện tỷ lệ chín trứng và phát triển phôi ở

Tỷ lệ trứng chín ở hai nghiệm thức bổ sung β-mercaptoethanol cao hơn nghiệm thức đối chứng, nên β-mercaptoethanol có vai trò cải thiện tỷ lệ trứng chín mà tốt nhất là ở nồng độ 50 àM. Do đó, trứng sẽ phát triển tốt và đạt tỷ lệ chín cao hơn đối chứng. Nhƣng nếu nồng độ GSH quá cao cũng sẽ làm mất cân bằng thành phần của các chất trong môi trường nội bào, gây ảnh hưởng xấu đến sự phỏt triển của trứng.

Do vậy, khi bổ sung β-mercaptoethanol với nồng độ 100 àM đó cho tỷ lệ trứng chớn thấp hơn so với 50 àM. Kết quả của chúng tôi thấp hơn của Kim (2004), có thể do ảnh hưởng của rất nhiều yếu tố trong quá trình nuôi trứng. Trứng đƣợc lấy từ chó cái ở nhiều giai đoạn sinh sản khác nhau, nên chất lƣợng trứng không đồng nhất, và có thể là do sự nhiễm khuẩn trong quá trình nuôi cấy làm ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của trứng.

Trong đề tài này, chúng tôi phải dùng hóa chất tự pha chứ không có nguồn hóa chất tổng hợp nên rất khó kiểm soát. Mặt khác, nguồn mẫu đƣợc lấy trực tiếp từ lò mổ nên nguy cơ nhiễm là rất cao.

Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ orcein phù hợp cho quy trình nhuộm trứng Hiện nay, để xác định các giai đoạn phát triển của nhiễm sắc thể, hầu hết các

Tuy nhiên, do thực tế chúng tôi không có điều kiện nhuộm huỳnh quang, nên chỉ có thể xác định tỷ lệ trứng chín bằng orcein, và thí nghiệm đã tiến hành thử trên 2 nồng độ orcein khác nhau: 1% và 0,75%. Nhƣ thế, có thể sử dụng nồng độ nào cũng không ảnh hưởng nhiều tới khả năng bắt màu nhiễm sắc thể của orcein. Tuy nhiờn, điều đỏng núi ở đõy là tỷ lệ nhỡn thấy rừ cỏc giai đoạn nhiễm sắc thể quá thấp, điều này sẽ gây sai lệch trong việc đánh giá tỷ lệ trứng chín để làm cơ sở cho quá trình thụ tinh.

Kinh nghiệm của người thao tác: tất cả các khâu của quá trình nhuộm trứng đều thủ công, do đó kinh nghiệm là một yếu tố rất quan trọng để giữ trứng không bị thất lạc trong quá trình thao tác và ngâm trong dung dịch acetic-ethanol. Orcein để thời gian lâu có thể bị lắng, do đó làm giảm khả năng bắt màu nhiễm sắc thể, hoặc để lâu nên acetic và ethanol có thể bay hơi làm sai lệch nồng độ. Trong đề tài này chúng tôi đã tiến hành thử nghiêm thụ tinh trong cả hai môi trường trên, sau 24 giờ thụ tinh thì tiến hành nhuộm bằng orcein để quan sát sự hình thành tiền nhân.

Trong môi trường TYH không có kết quả tạo thành tiền nhân, còn khi dùng môi trường Fert-TALP thì chỉ có một tiền nhân duy nhất được hình thành. Tuy nhiên cũng có thể nói rằng môi trường Fert-TALP dùng trong quy trình này tương đối phù hợp hơn môi trường TYH.  Lớp lipid trong nội chất của trứng chó nhiều do đó rất khó quan sát đƣợc thể cực sau 72 giờ nuôi nên hầu hết trứng sau khi nuôi đƣợc đánh giá theo kinh nghiệm và mang đi thụ tinh.

 Thí nghiệm nhuộm trứng bằng orcein vẫn chƣa đạt tỷ lệ cao, do đó việc đánh giá tỷ lệ trứng chín chƣa đƣợc chính xác, điều này gây khó khăn cho việc bổ sung các chất khác (β-mercaptoethanol, EGF…) vào môi trường để tăng hiệu quả chín trứng.  Tinh trùng trong thí nghiệm lấy trực tiếp từ phần đuôi phó tinh hoàn của những chó đực từ lò mổ nên chất lƣợng tinh trùng không ổn định (nồng độ và hoạt lực), có thể là do chó đực bị nhốt một vài ngày trước khi mổ nên dễ bị stress, ngoài ra trong thời gian đó chó còn bị bỏ đói… đã ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh tinh và chất lƣợng của tinh trùng. Do đó mà nồng độ và hoạt lực tinh trùng sau khi hoat hóa thường không cao và có khi thấp hơn nồng độ cần cho thụ tinh rất nhiều.

 Trong môi trường thụ tinh của chúng tôi thiếu thành phần PHE stock so với môi trường thụ tinh của Kim et.al.

Một số kinh nghiệm trong IVF .1 Lấy mẫu

(2006), vì trong PHE stock có hypotaurine là yếu tố bảo vệ áp suất thẩm thấu trong môi trường.  Điều kiện thí nghiệm của chúng tôi chƣa đạt điều kiện vô trùng nên rất dễ bị tạp nhiễm trong thao tác. Dung dịch trữ mẫu phải đƣợc bổ sung kháng sinh vào mỗi ngày lấy mẫu để hạn chế sự nhiễm khuẩn.

Mẫu sau khi lấy phải đƣợc vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm càng nhanh càng tốt. Chú ý khâu sát trùng mẫu và dụng cụ vì đây là nguồn mẫu lấy từ ngoài nên khả năng nhiễm là rất cao. Tinh hoàn nếu nhƣ chƣa đƣa vào tủ cấy làm liền thì phải đƣợc trữ trong tủ lạnh, nhằm hạn chế sự hoạt động của tinh trùng do đó kéo dài thời gian sống của tinh trùng.

Tinh hoàn và buồng trứng sau khi mang về phòng thí nghiệm phải đƣợc sát trùng cẩn thận, tiến hành cắt bỏ màng bao ngoài, cho vào đĩa petri và đƣợc dán chặt bằng keo parafilm để hạn chế nhiễm khuẩn. Tủ cấy và dụng cụ thao tác phải được chiếu tia UV trước mỗi lần làm, tất cả dụng cụ phải được sát trùng cẩn thận trước khi mang vào phòng cấy và tủ cấy vô trùng. Tinh trùng từ phần đuôi phó tinh hoàn đƣợc lấy trực tiếp từ lò mổ, do đó hoạt lực và nồng độ thường không ổn định nên tốt nhất là tiến hành hoạt hóa tinh trùng liền sau khi mang mẫu về phòng thí nghiệm.

Thao tác hoạt hóa và đếm các chỉ tiêu tinh trùng phải tiến hành nhanh và chính xác vì tinh trùng sau khi hoạt hóa rất dễ bị kết dính và thời gian sống không lâu, do đó sẽ ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả thụ tinh.