Đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao tại Việt Nam

Đặc điểm hệ gen Mycobacteria tuberculosis

Các protein được mã hoá bởi các gen 104 PE được chia nhỏ hơn thành 3 lớp, lớp thứ nhất chứa 29 protein chỉ với vùng PE, lớp thứ hai gồm 8 protein trong đó vùng PE đi kèm với các trình tự đầu C độc lập, và lớp thứ ba gồm 67 protein tạo thành dưới họ PE-PGRS. PGRS (polymorphic GC-rich repetitive sequences) là nhóm các protein có vùng PE bảo thủ và đầu C mở rộng với sự lặp lại nhiều lần Gly-Gly-Ala hoặc Gly-Gly-Asn. Trong số 50 gen mã hoá cho các RNA chức năng thì chỉ có một operon RNA ribosome, operon này nằm ở vị trí cách 1,5 Mbp so với vị trí khởi đầu sao mã (losus oriC).

Tính mềm dẻo này rất có lợi cho sự sống sót trong các môi trường khác nhau bên trong cơ thể người cả trong trạng thái áp lực oxy cao trong phế nang và các điều kiện kỵ khí, vi kỵ khí trong các nang lao.

Các trình tự chèn

Các promoter của IS thường định vị một phần bên trong trình tự IR về phía đầu gen Tpase, sự sắp xếp này có thể cung cấp một cơ chế tự điều hoà sự tổng hợp Tpase bằng cách gắn Tpase. Đặc điểm khác của IS là có khả năng chèn, đa số tạo nên các trình tự DNA ngắn lặp lại trực tiếp (DR-Direct Repeat), độ dài của DR vào khoảng từ 2 đến 14bp, chèn vào chuỗi DNA tại các vị trí nhất định. Một số trình tự chèn có tác dụng hoạt hoá sự biểu hiện của các gen lân cận, trong trường hợp di chuyển tạo nên vị trí thích hợp thì các promoter mới có khả năng điều khiển sự biểu hiện của các gen bên cạnh.

Thông qua biểu hiện và hoạt động của Tpase như cô lập các tín hiệu khởi đầu dịch mã, thay đổi khung dịch mã, kết thúc dịch mã, tác động đến sao mã và độ bền của Tpase [45].

Gen 23S rDNA

Fomukong và cộng sự cũng nghiên cứu và thấy rằng một số chủng từ Malaysia, Tanzania vad Oman cũng có duy nhất một bản sao của IS6110 [32]. Tuy nhiên, IS1081 cũng rất hữu ích cho các thao tác di truyền và phát triển các xét nghiệm chẩn đoán phát hiện vi khuẩn lao dựa trên phản ứng PCR [21, 31]. Sự khác nhau đáng kể giữa các loài không phải mycobacteria và mycobacteria có ý nghĩa trong lâm sàng cho thấy giá trị tiềm năng của vùng này trong chẩn đoán.

Theo tác giả Mekonnen Kurabachew và cộng sự (2004) gen đích 23S rDNA có mặt ở tất cả các chủng lao gây bệnh do đó sử dụng cặp mồi đặc hiệu khuếch đại vùng gen đích 23S rDNA là một thuận lợi cho việc phát hiện M.

Các hóa chất và thiết bị

Miền Bắc: Bệnh viện Lao và Bệnh phổi TƯ – Kí hiệu chủng TB02 Miền Trung: Bệnh viện Đa Khoa TW Huế - Kí hiệu chủng TB05 Miền Nam: Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch – Kí hiệu chủng TB06. Tất cả các mẫu chủng trên được phân lập sau đó tăng sinh trên môi trường Lowenstein rồi tách chiết thu DNA sử dụng trong quá trình nghiên cứu. Cỡ mẫu được tính theo công thức tính cỡ mẫu theo khuyến cáo của WHO cho các nghiên cứu dịch tễ học [54].

P : Tỉ lệ ước đoán trong quần thể (tỷ lệ ước đoán khuyết gen đích IS6110 ở Việt Nam là 5 % theo các nghiên cứu trong nước công bố). Cách lấy mẫu: Thu thập ngẫu nhiên chủng vi khuẩn phân lập được trong khoản thời gian thuộc giai đoạn 2007-2010 tại các điểm nghiên cứu. Các hóa chất và thiết bị chính phục vụ cho nghiên cứu được trình bày trong bảng 2.1 và 2.2.

Các cặp mồi được sử dụng trong phát hiện gen đích

Theo tác giả Mekonnen Kurabachew và cộng sự đã cho thấy gen đích 23S rDNA có ở tất cả các chủng lao gây bệnh [41]. Chúng tôi đã tham khảo, kiểm tra và lựa chọn cặp mồi khuếch đại ADN có độ dài 118 bp nằm trong gen 23S rDNA mã hoá cho tiểu phần 23S của rRNA. Theo các tác giả Ấn Độ và trên thế giới đã chứng minh trình tự IS 1081 cũng có giá trị rất lớn trong chẩn đoán phát hiện M.

Thiết kế nghiên cứu

Thiết kế nghiên cứu là nghiên cứu mô tả với quần thể nghiên cứu là chủng vi khuẩn lao phân lập trên cả 3 miền của Việt Nam và thông số nghiên cứu là tỷ lệ xuất hiện các gen đích đặc trưng phục vụ cho chẩn đoán của quần thể chủng vi khuẩn lao ở Việt Nam. Kiểm tra tỷ lệ khuyết IS6110, IS1081 và 23S rDNA trên các chủng lao ở ba miền Bắc Trung Nam bằng phản ứng multiplex PCR. Các chủng lao của ba miền Bắc Trung Nam được tách DNA và chạy multiplex PCR để kiểm tra tỷ lệ xuất hiện các trình tự IS6110, IS1081 và 23S rDNA.

Với những chủng lao nghi khuyết các trình tự đặc trưng cho các gen đích IS6110, IS1081 và 23S rDNA sẽ được thu nhận và kiểm tra lại bằng phản ứng PCR đơn mồi. Kết quả về hiện tượng khuyết gen được thống kê ở từng miền và so sánh với nhau.

Sơ đồ nghiên cứu

Các kĩ thuật sử dụng trong nghiên cứu 1. Tách chiết DNA

Bước 9: Hút lấy phần dịch nổi ở phía trên ở cuối bước 7 (tránh hút lớp ngăn cách giữa 2 pha dịch) cho vào tube chứa sẵn cồn và NaAC đã chuẩn bị ở bước 8 (trường hợp cồn 95% cần chia đều dịch nổi vào 2 tube đó), lắc đảo ngược vài lần. Phản ứng PCR và multiplex PCR là một chuỗi chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 bước được thực hiện trên máy luân nhiệt 9700 và iCycler. Bước 2: Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của mồi) cho phép các mồi bắt cặp với DNA khuôn, nhiệt độ này dao động trong khoảng 50 đến 70oC phụ thuộc Tm của mồi sử dụng và thời gian kéo dài từ 30 đến 1 phút 30 giây.

Để tìm nhiệt độ tối ưu cho từng cặp mồi và cho cả 3 cặp mồi trong phản ứng multiplex PCR chúng tôi sử dụng phương pháp gradient nhiệt. Bước 3: Nhiệt độ tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase hoạt động tổng hợp tốt nhất, thời gian tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại và đặc tính của DNA Polymerase. Đối với nghiên cứu này chúng tôi sử dụng thành phần và chu trình nhiệt cho phản ứng multiplex PCR đã được tác giả Nguyễn Thái Sơn và cộng sự thuộc Trung tâm Nghiên cứu Sinh Y Dược – Học viện Quân Y tối ưu.

Sản phẩm của phản ứng PCR sau đó sẽ được điện di trên gel Agarose 1,2% để phân tích kích thước các gen đích cần nghiên cứu. Các chủng lao nghi khuyết các trình tự đặc trưng IS6110, IS1081 và 23S rDNA được kiểm tra lại bằng phản ứng PCR đơn mồi. Điện di DNA là một phương pháp đặc biệt quan trọng trong nghiên cứu sinh học phân tử vì đây là phương pháp duy nhất để có thể quan sát được các phân tử DNA bằng mắt thường.

DNA mang điện tích âm di chuyển từ cực âm sang cực dương, tốc độ di chuyển phụ thuộc vào kích thước phân tử, dạng cấu trúc DNA, nồng độ Agarose, điện thế, nhiệt độ và thành phần chất điện di. Dựa vào kích thước từng đoạn gel được nghiên cứu và khả năng phân tách của gel Agarose, chúng tôi sử dụng kỹ thuật điện di trên gel Agarose 1,2% nhằm mục đích xác định khoảng kích thước các băng khi được điện di cùng thang DNA chuẩn.