Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của lá cây cà phê chè (Coffea arabica, Rubiaceae)

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1,2 kg mẫu khô đã nghiền nhỏ đƣợc ngâm chiết lần lƣợt với từng loại dung môi: n-Hexan, etylaxetat, metanol trong thiết bị siêu âm, ở nhiệt độ 50. Sau đó các dịch chiết riêng biệt đƣợc lọc qua giấy lọc và loại bỏ dung môi bằng thiết bị cất quay ở nhiệt ≤ 50 0C dưới áp xuất giảm. Thử hoạt tính vi sinh vật kiểm định đối với 3 loại cặn thô thu đƣợc ở trên tại Phòng thử hoạt tính sinh học -Viện Hoá học -Viện khoa học và Công nghệ Việt Nam.

- Sắc ký cột thường dùng Silica gel Merck 63-200 nm, cột pha đảo bằng các dung môi và hệ dung môi thích hợp. Các chất phân lập đƣợc ở dạng tinh khiết là đối tƣợng để khảo sát các đặc trƣng vật lý: màu sắc, mùi, dạng thù hình, Rf, điểm nóng chảy (Mp), đo độ quang hoạt (αD) v.v. Các số liệu thực nghiệm của các chất sạch đƣợc dùng xác định cấu trúc hoá học của chúng.

Các dung môi để ngâm chiết mẫu đều dùng loại tinh khiết (pure), khi dùng cho các loại sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, sắc ký lớp mỏng điều chế phải sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA). Sắc ký lớp mỏng tự chế với các kích thước khác nhau đã dùng loại silica gel G60 của hãng Merck tráng trên tấm thuỷ tinh và hoạt hoá ở nhiệt độ độ dày 0,2 mm (Art. - Nhiệt độ nóng chảy đo trên kính hiển vi Boёtus (Đức) hoặc trên máy Electrothermal IA-9200.

- Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT - 410 (Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam) dưới dạng viên nén KBr. - Phổ khối lƣợng ghi trên máy MS-Engine-5989-HP (Viện Hoá học - Khoa học và Công nghệ Việt nam) ion hóa bằng va chạm electron (EI) ở 70eV, sử dụng ngân hàng dữ liệu DATABASE/WILLEY 250L hoặc trên máy sắc ký lỏng ghép khối phổ với đầu dò MSD (LC-MSD-Trap-SL) sử dụng mode ESI và đầu dò DAD.

THU NHẬN CÁC DỊCH CHIẾT TỪ LÁ CÂY CÀ PHÊ CHÈ 1. Thu nhận các dịch chiết

Kết quả thu nhận các cặn dịch chiết từ lá cây Cà phê chè ở Hoàng Quế, Đông Triều, Quảng Ninh đƣợc nêu trong bảng 2.1. Hoà tan cặn trong 3 ml cloroform - lấy dịch cloroform để làm phản ứng định tính các sterol và thuốc thử Lieberman - Bourchardt (gồm hỗn hợp 1 ml anhydric axetic + 1 ml cloroform để lạnh ở 00C, sau đó cho thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc). Lấy 2ml nước lọc vào ống nghiệm, thêm một ít bột magiê (Mg) hoặc Zn, sau đó cho vào 5 giọt HCl đậm đặc, đun trong bình cách thuỷ vài phút.

Nếu chất lỏng ở ống có kiềm trong hơn ở ống không kiềm có thể xem là phản ứng dương tính, nếu đem axit hoá ống có kiềm bằng một vài giọt HCl đậm đặc sẽ làm cho dịch đang trong vẩn đục và màu vàng xuất hiện có thể tạo ra tủa là phản ứng dương tính. Ngoài ra có thể làm phản ứng điazo hoá với axit sulfanilic trong môi trường axit, nếu cho màu da cam đến cam nhạt, cho kết quả dương tính đối với cumarin. + Phản ứng Legal: cho vào ống nghiệm 0,5ml dịch thử, thêm vào 1 giọt dung dịch natri prussiat 0,5% và 2 giọt NaOH 10% nếu xuất hiện màu đỏ là phản ứng dương tính với vòng butenolit.

Cách tiến hành: Lấy 0,01g cặn các dịch chiết cho vào ống nghiệm thêm vào 1ml dung dịch 1, lắc đều cho tan hết, nghiêng ống nghiệm và cho từ từ. 1ml dung dịch 2 theo thành ống nghiệm, quan sát sự xuất hiện của màu đỏ hay nâu đỏ, giữa hai lớp chất lỏng. Kết quả phân tích định tính các nhóm chất trong lá cây Cà phê chè (Coffea arabica) đƣợc nêu trong bảng 2.2.

MHB (Mueller - Hinton Broth), MHA (Mueller - Hinton Agar), TSB (Tryptic Soy Broth), TSA (Tryptic Soy Agar)cho vi sinh vật; SAB, SA cho nấm. Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật. Giá trị IC50 đƣợc tính toán dựa trên số liệu đo độ đục tế bào bằng máy Tecan (Genios) và phần mềm raw data.

+ Thử định tính theo phương pháp khuếch tán trên thạch, sử dụng khoanh giấy lọc tẩm chất thử theo nồng độ tiêu chuẩn. + Các mẫu cho hoạt tính (+) ở bước 1 sẽ được tiến hành thử tiếp bước 2 để tính ra nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) theo phương pháp hiện đại của Vanden Bergher và Vlietlink tiến hành trên phiến vi lƣợng 96 giếng, kháng sinh kiểm định bao gồm: Ampicilin, Tetracylin, Amphoterixin B và Nystatin.

PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC CHẤT 1. Cặn dịch chiết n-hexan (Cof H)

Nhận xét: Các mẫu thử không có tác dụng kháng các chủng vi sinh vật trên. Dịch rửa thoát ra từ cột đƣợc thu ở những thể tích nhỏ (510ml/phân đoạn). Kiểm tra cặn thu đƣợc bằng sắc ký lớp mỏng và hiện màu bằng thuốc thử vanilin - H2SO4 5% xấy ở nhiệt độ > 100 0C, sau đó các phân đoạn giống nhau đƣợc gộp lại một và đuổi kiệt dung môi.

Rửa giải cột bằng dung môi chlorofom, cất loại dung môi, thu đƣợc khối chất rắn, kiểm tra SKLM trong hệ dung môi chlorofom: metanol (9:1) thấy chất rắn có hai chất là thành phần chính. Sau đó, lọc qua giấy lọc đƣợc dịch đem kiềm hoá bằng NaHCO3 đến PH = 10 rồi đem chiết với chloroform mỗi lần chiêt 150 ml dịch với 200 ml chloroform, dịch sau khi chiết đem làm khô và cất dưới áp xuất giảm thấy những tinh thể màu trắng, rửa bằng MeOH đƣợc tinh thể đem xác định nhiệt độ nóng chảy, xác định cấu trúc cho kết quả giống nhƣ COF.Anc. COF.Anc thu đƣợc bằng phương pháp sắc kí cột khi phân tích cặn Cof E.

Kểm tra SKLM với COF.Anc hệ dung môi CM (9:1) (Hệ D) dùng thuốc thử vanilin không hiện màu trên bản mỏng nhƣng dùng hơi I2 thấy có 1 vết tròn.