Xác định hoạt tính và tinh sạch protease từ hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki trên môi trường bán rắn
MỤC LỤC
LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
- Vật Liệu
- Phương pháp thí nghiệm 1. Bố trí thí nghiệm
Thiết bị lọc hút chân không. Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp, hãng Biorad gồm phễu đổ gel, flow adaptor, vòi hút chân không để khử khí cho dung dịch. Các dụng cụ để chạy điện di : Bộ điện di dứng, bộ nguồn chạy điện di, đầu típ, eppendorf, phao để eppendorf. Bố trí thí nghiệm. Thí nghiệm 1 : Xác định hàm lượng protein và hoạt tính protease của dịch chiết enzyme thô. Khuấy đều hỗn hợp trong thời gian 1 tiếng bằng máy khuấy từ. Lọc hỗn hợp qua vải thô. Dịch lọc thu được tiếp tục lọc bằng thiết bị lọc hút chân không. Loại bỏ cặn và thu lấy dịch. Dịch chiết enzyme thô được xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford và hoạt tính protease theo phương pháp Amano. a) Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford. Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại và sự thay đổi màu xảy ra khi Coomasie Brilliant Blue liên kết với protein trong dung dịch acid. Trị số mật độ quang của các ống từ 1 đến 9 sau khi trừ đi trị số của ống đối chứng sẽ xây dựng được đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang (∆OD) theo nồng độ protein.
Mật độ quang của mẫu cũng trừ đi trị số mật độ quang của ống đối chứng, rồi chiếu vào đường chuẩn để suy ra lượng protein có trong dung dịch mẫu thí nghiệm (àg/ml). b) Xác định hoạt tính enzyme theo phương pháp Amano. Dùng casein làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của enzyme protease trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin. Mẫu đối chứng : lấy 1 ml nước cất thay cho 1 ml dung dịch enzyme và tiến hành các bước tương tự như mẫu thí nghiệm với cùng điều kiện.
Một đơn vị hoạt tính (ĐVHT) enzyme protease được xác định là lượng enzyme để tạo ra lượng amino acid tương đương với 100 àg tyrosine trong 1 ml dịch lọc dưới điều kiện thí nghiệm. Chiết enzyme từ chế phẩm enzyme thô theo mô tả ở thí nghiệm 1, dịch chiết thu được đem đi tủa với các tác nhân tủa là muối (NH4)2SO4 và cồn 960. Cho từ từ muối (NH4)2SO4 vào để muối có thời gian hòa tan trong dịch enzyme. Số đơn vị hoạt tính mg protein enzyme. Tiếp tục khuấy từ thêm 15 phút. Thu tủa, hòa lại trong 15 ml dung dịch đệm phosphate pH7. Để tránh làm biến tính protein, ethanol 960 phải được giữ lạnh trước khi tiến hành tủa. Thể tích dịch enzyme và thể tích cồntương ứng với mỗi nồng độ được sử dụng như bảng 3.4. Lắc đều hỗn hợp, bảo quản lạnh trong một giờ. Bỏ dịch, thu tủa, hòa trong 15 ml dung dịch đệm phosphate pH7. c) Xác định nồng độ muối (NH4)2SO4 và tỷ lệ cồn tối ưu để tủa enzyme protease. Nồng độ muối và tỷ lệ cồn tối ưu cho việc tủa enzyme protease là giá trị mà ở đó hoạt tính protease thu được cao nhất. Dịch hòa tan tủa thu được khi tủa protease ở nồng độ muối và tỷ lệ cồn tối ưu ở thí nghiệm 2 được xác định hoạt tính protease theo phương pháp Amano ở các giá trị pH và nhiệt độ khác nhau. a) Xác định pH tối ưu cho hoạt động của protease.
Ở giá trị pH nào cho hoạt động của protease mạnh nhất (hoạt tính cao nhất) thì đó là pH tối ưu cho hoạt động của enzyme. b) Xác định nhiệt độ tối ưu. Ở nhiệt độ nào hoạt tính enzyme cao nhất thì đó là nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme. Dụng cụ và thiết bị. Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp, hãng Bio-Rad, Mỹ. Phễu đổ gel. Bình hút chân không. Bình đựng dung dịch đệm. Vòi hút chân không để khử bọt khí cho các dung dịch. Gel Bio-Gel P-100, hãng Bio-Rad : là các hạt polyacrylamide tạo lỗ, được điều chế bằng quá trình đồng polymer hóa acrylamide và N, N’-methylene-bis- acrylamide. Các gel này rất ưa nước và không mang điện tích, giúp việc lọc các hợp chất nhạy cảm qua gel đạt hiệu quả. b) Các bước tiến hành. Dịch ra khỏi cột được đo độ hấp thụ ở bước sóng 280 nm bằng detector trong hệ sắc ký và được thể hiện độ hấp thu dưới dạng sắc ký đồ bằng phần mềm LP Data View trên máy tính. Dịch được thu tự động bằng máy thu mẫu (collector), mỗi phân đoạn 2 ml. Xác định hàm lượng protein và hoạt tính enzyme protease. Dựa trên sắc ký đồ, tiến hành gom các phân đoạn thuộc cùng một peak. Các peak sẽ đuợc phân tích hàm lượng protein theo phương pháp Bradford và hoạt tính protease theo phương pháp Amano sau tinh sạch như thí nghiệm 2. c) Tính hiệu suất về hoạt tính enzyme protease và độ tinh sạch của enzyme sau tinh sạch bằng sắc ký lọc gel.
HT enzyme 2 : Hoạt tính enzyme protease sau tinh sạch (UI/ml dung dịch enzyme sau tinh sạch.). Hàm lượng protein sau tinh sạch. HTR enzyme 1 : Hoạt tính riêng enzyme trước mỗi lần tinh sạch. HTR enzyme 2 : Hoạt tính riêng enzyme tương ứng sau mỗi lần tinh sạch. HTR enzyme 1 : Hoạt tính riêng của enzyme protease trước tinh sạch HTR enzyme 2 : Hoạt tính riêng của enzyme protease sau tinh sạch. 3.3.1.7 Thí nghiệm 5 : Xác định trọng lượng phân tử enzyme protease bằng phương pháp điện di SDS - PAGE. a) Thiết bị và dụng cụ Bộ điện di đứng. Tiến hành chạy điện di dịch chiết enzyme thô của Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki đồng thời với peak được dự đoán là protease mà ta quan tâm của cả hai chủng khi tủa protein bằng cồn. Trọng lượng phân tử của các protein chưa biết trọng lượng phân tử có thể xác định thông qua giá trị Rf của chúng qua phương pháp ngoại suy từ đồ thị.
