Thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở Ninh Bình và Phú Yên và ứng dụng kit LAMP trong chẩn đoán
MỤC LỤC
Đặc điểm lâm sàng, chẩn đoán và điều trị bệnh sán lá gan nhỏ trên người
Tùy thuộc vào thời gian mắc bệnh và cường độ nhiễm cũng như các yếu tố ảnh hưởng mà các biểu hiện lâm sàng điển hình hay không điển hình. Năm 2009, sán lá gan Clonorchis sinensis được Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC) thuộc Tổ chức Y tế Thế giới xếp vào loại "gây ung thư cho người" (chất gây ung thư nhóm I) dựa trên sự liên quan đến căn nguyên của ung thư đường mật [67].
Các phương pháp xét nghiệm xác định tình trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người
Xét nghiệm miễn dịch chẩn đoán sán lá gan nhỏ: phản ứng ELISA (enzyme-Linked immunosorbent assay) có độ nhạy cao, độ đặc hiệu tùy thuộc vào từng loại test và còn nhiều tranh luận, có hiện tượng dương tính kéo dài và dương tính chéo giữa các loài, khó triển khai tại thực địa [73]. Gần đây có xu hướng chuyển sang các phương pháp khuếch đại ADN đẳng nhiệt với ưu điểm là độ nhạy và độ đặc hiệu tương đương kỹ thuật PCR nhưng loại bỏ được các bước luân nhiệt nên chỉ cần các thiết bị xét nghiệm đơn giản, nhỏ gọn, thời gian xét nghiệm rút ngắn xuống còn 30 - 60 phút, có khả năng phát triển thành các bộ kit phân tử cho phép ứng dụng được tại thực địa.
Kỹ thuật LAMP và nghiên cứu chế tạo bộ kít LAMP xét nghiệm phát hiện nhiễm sán lá gan nhỏ trên người
Các bộ sinh phẩm đã được thương mại hóa trên thị trường có ưu điểm là đã được chuẩn hóa, xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, ngưỡng phát hiện đối với cỏc tỏc nhõn gõy bệnh, hướng dẫn sử dụng rừ ràng dễ thực hiện nhưng cũng có một số nhược điểm như giá thành cao, thời gian làm thủ tục nhập khẩu lâu nên hạn sử dụng còn lại ngắn, làm cho các phòng thí nghiệm không chủ động được các hoạt động của mình. Để đánh giá tính ổn định của bộ kit cần tiến hành bảo quản bộ kit trong các điều kiện khác nhau và hàng tháng tiến hành thực hiện xét nghiệm trên các mẫu chuẩn mà mẫu lâm sàng cố định đã được bảo quản trong các điều kiện tối ưu đảm bảo không thay đổi bản chất của mẫu; đánh giá tối thiểu 6 tháng và càng lâu càng tốt, hoạt động đánh giá được dừng lại khi kết quả đánh giá 2 lần liên tiếp không đảm bảo tính ổn định.
![Hình 1.10. Các mồi thiết kế và vị trí bắt cặp trên gen đích [78]](https://media.store123doc.com/figures/004/235/hinh-moi-thiet-ke-vi-bat-cap-dich-4235220.webp)
Mục tiêu 1: Mô tả thực trạng và một số yếu tố liên quan nhiễm sán lá gan nhỏ trên người tại hai xã trọng điểm thuộc tỉnh Ninh Bình và Phú
Chọn chủ đích xã Yên Lộc thuộc huyện Kim Sơn, tỉnh Ninh Bình và xã An Mỹ thuộc huyện Tuy An, tỉnh Phú Yên là hai xã nằm trong vùng sán lá gan nhỏ lưu hành với tỷ lệ nhiễm cao (được coi là những xã trọng điểm về tình trạng nhiễm sán lá gan nhỏ), tại đây có nhiều ao hồ nuôi cá, dân cư có thói quen ăn gỏi cá, vị trí giao thông thuận tiện, đa dạng sinh thái, thuận tiện cho tác nhân gây bệnh và vật chủ. Các đối tượng nghiên cứu được xét nghiệm phân bằng phương pháp Kato- Katz được thực hiện ngay tại địa điểm nghiên cứu, tìm trứng và sán trưởng thành trong phân được thực hiện ngay tại địa điểm nghiên cứu, đồng thời các mẫu phân được xét nghiệm bằng phương pháp real-time PCR được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm, Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương.
Mục tiêu 2: Chế tạo kit LAMP xét nghiệm nhiễm Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini trên người ở quy mô phòng thí nghiệm
- Cỡ mẫu để đánh giá tính ổn định của bộ kít: 06 mẫu trong đó có 01 mẫu chứng âm (nước khử ion), 01 mẫu chứng chuẩn dương ở nồng độ được sử dụng làm ngưỡng phát hiện của kỹ thuật LAMP, 01 mẫu ADN tách từ con sán lá gan nhỏ trưởng thành, 01 mẫu ADN tách từ mẫu phân dương tính với sán lá gan nhỏ và 02 mẫu tách từ mẫu phân âm tính. - Thiết kế mồi sử dụng các phần mềm tin sinh chuyên dụng như Bioedit V.7.2.6.1, Primer Explorer v.5, Primer Blast… để tìm các vùng bảo tồn trên các vùng gene mục tiêu, thiết kế mồi, kiểm tra các đặc tính của các mồi đã thiết kế, hướng dẫn SOP ký hiệu NIMPE.HD 03.PP/37 “Quy trình thiết kế, đánh giá và lựa chọn bộ mồi sử dụng cho kít LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ”.
Đạo đức trong nghiên cứu
- Kiểm soát quá trình phỏng vấn đối tượng nghiên cứu và quy trình xét nghiệm phân theo phương pháp Kato-Katz theo hướng dẫn của WHO (1994), kỹ thuật real time real-time PCR. - Mã hóa số liệu: lô thử nghiệm, đợt thử nghiệm, ngày thử nghiệm, người thử nghiệm. Thực trạng và một số yếu tố liên quan nhiễm sán lá gan nhỏ trên người.
BÀN LUẬN
Mô tả thực trạng và một số yếu tố liên quan nhiễm sán lá gan nhỏ trên người tại hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình và Phú Yên (2018-2020)
Một nghiên cứu tại Nam Định cho thấy một số người có nhận thức về nguy cơ nhiễm sán do ăn cá sống; tuy nhiên, nhiều người chấp nhận những rủi ro và tiếp tục ăn cá sống vì biết thuốc điều trị hiệu quả có sẵn [95], nhiều người không nhận thức được nguy cơ nhiễm sán lá gan khi ăn cá sống, hoặc do hiểu biết chưa đủ hoặc chưa đúng. Phương pháp Kato-Katz được WHO khuyến nghị và sử dụng rộng rãi [69] trong các điều tra dịch tễ học lớn, giúp đánh giá hiệu quả của thuốc, theo dừi và đỏnh giỏ can thiệp,… Tuy nhiờn, độ nhạy của kỹ thuật Kato-Katz thấp, đặc biệt là đối với các trường hợp nhiễm cường độ nhẹ [5], [6]. Điều này cho thấy các phương pháp chẩn đoán sán lá gan nhỏ bằng hình thái dễ áp dụng, thường được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu cộng đồng, tuy nhiên rất các phương pháp này có độ nhạy thấp, dễ nhầm lẫn, dễ bỏ sót các trường hợp nhiễm nhẹ, đặc biệt là kết quả phụ thuộc nhiều vào kinh nghiệm của kỹ thuật viên.
Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ tại các điểm nghiên cứu cũng phù hợp với nhận xét của Bộ Y tế (2016), có ít nhất 32 tỉnh có bệnh sán lá gan nhỏ (Clonorchis hoặc Opisthorchis) lưu hành, trong đó các tỉnh lưu hành nặng nhất là Nam Định, Ninh Bình, Hòa Bình, Hà Nội, Thanh Hóa, Phú Yên, Bình Định. Sự chênh lệch này có thể giải thích do tỷ lệ người dân ăn gỏi cá với tần suất cao tại xã An Mỹ (Phú Yên) lớn hơn xã Yên Lộc (Ninh Bình), tỷ lệ nhiễm cường độ trung bình và số trứng trung bình/1 gam phân ở người dân tại xã An Mỹ (Phú Yên) lại lớn hơn tại xã Yên Lộc (Ninh Bình).
Một số yếu tố liên quan đến tình trạng nhiễm sán lá gan nhỏ ở người 1. Liên quan giữa tuổi và tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ
Liên quan giữa tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ và tình trạng ăn gỏi cá Tương tự như các trường hợp nhiễm sán lá gan khác, đa số các nghiên cứu về hành vi, thói quen, tập quán nuôi cá, ăn rau sống (thủy sinh) trên thế giới và Việt Nam đều thống nhất, yếu tố chính làm lây nhiễm sán lá gan nhỏ là thói quen ăn cá sống hoặc cá chưa nấu chín của người dân [95]. Đối với lượng ADN khuôn đưa vào phản ứng, theo một số tác giả khi tăng lượng ADN tổng số ban đầu với các mẫu lâm sàng có thể làm tăng độ nhạy, đặc biệt là ở những mẫu có nồng độ ADN đích thấp, tuy nhiên điều này phụ thuộc nhiều vào lượng tế bào ban đầu sử dụng cho tách chiết, cũng như phương pháp tách chiết và lượng dung dịch hòa tan ADN cho vào khi tách chiết. Trong nghiên cứu này, lượng ADN tổng số được tách từ các tế bào trứng sán có trong mẫu phân thường có cường độ thấp, với quy trình tách ADN bằng bộ sinh phẩm QIAamp DNA mini stool kit, lượng buffer hòa tan ADN cố định, việc khảo sát đánh giá lượng ADN khuôn ban đầu đưa vào thử nghiệm để lựa chọn ra thể tích phù hợp được tiến hành với lượng ADN khuôn ban đầu đưa vào từ 2-5 àl.
Gần đây, chất chỉ thị màu được sử dụng thêm vào phản ứng LAMP là các chỉ thị nhạy với pH như là hydroxyl napthol Blue (HNB) [124], xanh malachite [125] cho thấy hiệu quả khi các chất chỉ thị này được bổ sung vào đệm LAMP trước khi tiến hành phản ứng không ảnh hưởng đến hoạt động của Bst DNA polymerase, đồng thời loại bỏ nguy cơ tạp nhiễm giữa các mẫu. So với các kết quả xét nghiệm phát hiện sán lá gan nhỏ tại xã Yên Lộc, Kim Sơn, Ninh Bình năm 2020 cho thấy nhiễm sán lá gan nhỏ đã giảm rất nhiều so với thời điểm 2018 trong điều tra của chúng tôi và cũng như kết quả điều tra của một số tác giả khác giai đoạn 2016-2017, [29] điều này có thể do hiệu quả của các biện pháp can thiệp xét nghiệm liên tục và điều trị được thực hiện bởi rất nhiều chương trình, dự án tăng cường phòng chống bệnh sán lá gan nhỏ tại khu vực, đồng thời cũng có thể do sự thay đổi tập quán ăn gỏi cá của người dân địa phương khi được tuyên truyền nâng cao nhận thức về bệnh sán lá gan nhỏ.
Đặc điểm gia đình của đối tượng nghiên cứu Q5 Nhà tiêu hợp vệ sinh
Các trình tự gen nad1 trên ngân hàng gen NCBI sử dụng cho thiết kế bộ mồi LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ O. No Chủng/Nguốc gốc Mã số trên ngân hàng gen 1 Opthorchis viverrini, Việt Nam MF287778.1. Các trình tự gen Nad1 trên ngân hàng gen sử dụng cho thiết kế bộ mồi LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ C.
Kết quả so sánh độ tương đồng giữa sản phẩm PCR F3-B3 với trình tự gen ty thể của sán lá gan nhỏ trên ngân hàng gen. Kết quả khảo sát ngưỡng phát hiện thứ cấp của bộ kít LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ O.
