Quy trình tổng hợp và bào chế kem Diethyltoluamid theo tiêu chuẩn USP 41
MỤC LỤC
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
Thiết bị nghiên cứu
7 Máy đo khuếch tán thuốc qua da tự động FDC-6 Mỹ Thiết bị trong đánh giá, kiểm nghiệm.
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
+ Đánh giá khả năng thấm và mức độ lưu trữ trong da của dược chất trong mẫu kem bào chế được.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Phương pháp tổng hợp hóa học
Hỗn hợp phản ứng được khuấy và gia nhiệt đến nhiệt độ sôi của hỗn hợp phản ứng (90oC) cho đến khi hết acid m-toluic (15 phỳt, theo dừi điểm kết thúc phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi n-hexan : ethyl acetat (1:1) và phát hiện màu màu dưới đèn soi tử ngoại ở bước sóng 254 nm). Mẫu được pha loóng từ 10-100 lần (phù hợp với khoảng nồng độ tuyến tính đã xây dựng), lọc qua màng 0,45 àm, định lượng DEET giải phúng bằng phương phỏp HPLC theo điều kiện đã chọn. * Mức độ lưu giữ trong da. Sau khi kết thúc thử nghiệm đánh giá tính thấm, lấy màng da chuột ra khỏi bình Franz, rửa sạch bằng nước cất ấm. Cắt nhỏ và ngâm bằng MeOH trong ống Falcon 14 ml, siêu âm 60 phút. Dịch trong được bổ sung methanol vừa đủ 25 ml. Lọc qua màng 0,45 μl), pha động là methanol : nướcm và định lượng DEET bằng phương pháp HPLC theo điều kiện đã chọn.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
KẾT QUẢ CẢI TIẾN VÀ XÂY DỰNG MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP DIETHYLTOLUAMID
Quy trình tổng hợp DEET được thực hiện như mô tả ở trên, cố định các thông số, sử dụng chất trung hòa acid là NaOH và thay đổi dung môi lần lượt là benzen, n-hexan, acetonitril, diethylether, diclomethan, tetrahydrofuran, ethyl acetat, n-butanol, ethylen glycol với nhiệt độ tiến hành tương ứng là nhiệt độ sôi của dung môi. Cố định các thông số: tác nhân tạo acid clorid là SOCl2, giai đoạn 1 đun hồi lưu ở 90oC trong thời gian 15 phút, giai đoạn 2 thực hiện trong dung môi DCM nhưng ở 2 nhiệt độ khảo sát lần lượt là nhiệt độ phòng (18-20oC) và nhiệt độ sôi của dung môi CH2Cl2 (40oC) trong thời gian t2 phút để đánh giá hiệu suất tạo thành sản phẩm DEET. Tổng hợp DEET từ acid m-toluic theo quy trình ở trên được thực hiện với thời gian phản ứng giai đoạn 1 là 10 phút với tỉ lệ mol 4-DMAP:acid m- toluic được sử dụng bằng 1,5% nhưng có sự thay đổi NaOH bằng chất trung hòa acid khác là triethylamin và không sử dụng bất kì chất trung hòa acid nào.
KẾT QUẢ XÂY DỰNG QUY TRÌNH TỔNG HỢP DIETHYLTOLUAMID QUY MÔ 500 G/MẺ
Chính vì các lý do trên, đề tài lựa chọn hướng thứ hai: đi từ acid m- toluic và diethylamin sử dụng tác nhân halogen hóa là SOCl2 (phương pháp 2) cùng các thông số đã khảo sát được để xây dựng quy trình tổng hợp DEET quy mô 500 g/mẻ. Mẫu diethyltoluamid tổng hợp theo các quy trình xây dựng trong mục 3.2.3 được gửi kiểm nghiệm tại Viện kiểm nghiệm, nghiên cứu dược và trang thiết bị y tế quân đội – Cục Quân y, thử theo tiêu chuẩn quy định của dược điển Mỹ (USP 41). 97,0 5 Kết quả cho thấy: Nguyên liệu đạt các chỉ tiêu chất lượng về tính chất và định lượng trong nghiên cứu về độ ổn định ở điều kiện lão hóa cấp tốc, ở các thời điểm ban đầu, 3 tháng và 6 tháng bảo quản ở điều kiện nhiệt độ 40ºC.
KẾT QUẢ BƯỚC ĐẦU BÀO CHẾ KEM CHỨA DIETHYLTOLUAMID 15%
Trong các dạng thuốc mỡ (đặc biệt là dạng kem) thường dùng phối hợp các chất nhũ hóa với nhau để làm tăng độ ổn định và bền vững cho chế phẩm, triethanolamin khi trộn theo tỷ lệ cân bằng với một acid béo, như acid stearic sẽ tạo thành xà phòng anion có pH khoảng 8, có tác dụng nhũ hóa tạo nhũ tương D/N ổn định. Các công thức này có hệ tá dược phù hợp để tiến hành khảo sát đánh giá mức độ thấm và lưu giữ DEET trên da chuột đối với các công thức CT20 đến CT25 và công thức đối chiếu (Kem Remos) bằng phương pháp đo giải phóng thuốc như đã trình bày ở mục 2.3.4.3. Kết hợp thực nghiệm đánh giá mức độ hòa tan theo điều kiện “sink” nhận thấy với lượng dung môi ethanol 50% sử dụng trong thử nghiệm tính thấm đảm bảo hòa tan hết lượng DEET gấp 3 lần lượng thử nghiệm tính thấm trong khi dung môi pH 7,4 không hòa tan hết.
BÀN LUẬN
CẢI TIẾN VÀ XÂY DỰNG MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP DIETHYLTOLUAMID
Tổng hợp diethyltoluamid từ acid m-toluic và diethylamin sử dụng tác nhân CDI (Phương pháp 3). CDI là một tác nhân carbonyl hóa có hoạt tính cao có chứa hai nhóm rời acylimidazol. Do đó, CDI có thể hoạt hóa acid carboxylic hoặc nhóm hydroxyl để liên hợp với các nucleophile khác, tạo ra liên kết amid có độ dài bằng 0 hoặc liên kết N-alkyl carbamat có độ dài một carbon giữa các phân tử được liên kết ngang. Các nhóm acid carboxylic phản ứng với CDI để tạo thành N-acylimidazol có khả năng phản ứng cao. Các dạng trung gian hoạt động tạo ra bởi sự giải phóng carbon dioxid và imidazol [95]. Qua tham khảo tài liệu trên đề tài đã dự đoán xu hướng phản ứng và sơ đồ hóa quy trình tổng hợp như sau:. Cơ chế hoạt hóa của CDI tham gia vào phản ứng tạo DEET giữa acid m-toluic và diethylamin. Điều này được giải thích là với tỉ lệ CDI thấp thì sẽ không có đủ lượng để phản ứng với acid m-toluic. Bên cạnh đó, ở tỷ lệ 1:1,0 nồng độ các chất tham gia phản ứng giảm đi dẫn đến kéo dài thời gian phản ứng. Vì vậy, trong cùng một khoảng thời gian nhất định thì hiệu suất của phản ứng sẽ giảm ở tỷ lệ thấp hơn. Do lượng CDI ở tỷ lệ 1:1,2 đã đủ để phản ứng với acid m-toluic tạo sản phẩm trung gian trong khoảng thời gian 30 phút. Tuy nhiên, ở tỷ lệ 1:1,4 thì hiệu suất giảm do khi tinh chế cần thêm lượng nước để kéo CDI dư ra khỏi hỗn hợp phản ứng, điều này cũng làm một phần sản phẩm bị kéo theo vào pha nước). Dung môi n-hexan đạt hiệu suất thấp 52,80% trong khi dung môi ethyl acetat cho hiệu suất tạo sản phẩm cao 88,03%, tuy nhiên, đây là dung môi dễ cháy nổ, bên cạnh đó khi tiến hành phản ứng nhiệt độ xấp xỉ 80oC do đó dẫn tới mầu của sản phẩm có mầu nâu đen không đảm bảo yêu cầu cảm quan. Hỗn hợp sản phẩm cuối thu được gồm hoạt chất DEET quan sát thấy trên tấm sắc ký lớp mỏng (Rf = 0,4 hệ dung môi n-hexan:ethylacetat (1:1)) và một hỗn hợp các chất gồm triethylamin, diethylamin, acid cyanuric (1,3,5- triazin-2,4,6-triol) đều nằm ở phía dưới không bị kéo theo khi triển khai chạy sắc ký.
QUY TRÌNH TỔNG HỢP DIETHYLTOLUAMID 500 G/MẺ ĐẠT TIÊU CHUẨN USP 41
Quy trình tổng diethyltoluamid từ acid m-toluic được hoạt hóa bởi các tác nhân là những dẫn chất cloroformat: Đây là quy trình mới khá phức tạp, bên cạnh đó cũng yêu cầu cao với nhiệt độ bao gồm điều kiện nhiệt độ phản ứng phải thấp và phải bảo quản sản phẩm ở điều kiện lạnh để tránh sự thủy phân của các dẫn chất cloroformat và đảm bảo hiệu suất của quá trình phản ứng. Quy trình cải tiến tổng hợp diethyltoluamid từ acid m-toluic qua chất trung gian m-toluoyl clorid sử dụng tác nhân halogen hóa SOCl2 có những ưu điểm sau: Đây là quy trình đơn giản, các bước dễ thực hiện, sử dụng các hóa chất, dung môi cơ bản, dễ mua, có sử dụng các thiết bị và dụng cụ phổ biến, thường có trong các phòng thí nghiệm, hiệu suất cả quy trình cao. Quy trình 500 g/mẻ này có được các ưu điểm giống như quy trình thực hiện ở quy mô nhỏ hơn như: Thời gian ngắn (1,5 giờ), đơn giản (vì thao tác đơn giản, thiết bị, hóa chất thường dùng), dễ triển khai (dễ mua), giá thành cũng xấp xỉ như các nghiên cứu khác, hiệu suất cao (98,35%, cao hơn hẳn phương pháp dùng các dẫn chất cloroformat và sử dụng các tác nhân ngưng tụ).
BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG CÔNG THỨC BÀO CHẾ KEM CHỨA DIETHYLTOLUAMID
Bên cạnh đó, việc sử dụng Propylen glycol và PEG 400 gây ra tình trạng nhờn dính da trong 2-3 giờ đầu có thể gây khó chịu cho người sử dụng đã được đã được tác giả Lê Đại Nghĩa báo cáo trong luận văn thạc sĩ năm 2004, tuy nhiên công thức kem bào chế chứa những tá dược núi trờn vẫn đạt tỏc dụng xua muỗi trong thời gian theo dừi từ 6-10 giờ, do trong công thức có sử dụng hai tá dược nhằm mục đích tăng độ nhớt cho chế phẩm, hạn chế tốc độ bay hơi và sự thấm qua da của dược chất. Mục tiêu của đề tài là bào chế kem chứa diethyltoluamid nên không nhất thiết phải có những tá dược kể trên, chính vì điều này đã gợi ý đề tài thay đổi thành phần trong công thức để kết hợp với một số loại dầu khác sẵn có trong nước như dầu dừa, dầu parafin và dầu oliu. Đề tài lựa chọn dầu oliu để tiếp tục nghiên cứu do yếu tố thể chất ổn định nhất trong các mẫu kem nghiên cứu, bên cạnh đó theo tác giả Ruiz trong dầu oliu có các thành phần chính là acid oleic đóng vai trò chính giống như dịch chiết lá lô hội và các thành phần khác như vitamin A, D, E, polyphenol, muối khoáng, oleuropeosid, phytosterol, squalen và acid linoleic đóng vai trò dưỡng ẩm và bảo vệ da [103].
Đồ thị tương quan tuyến tính giữa diện tích peak và nồng độ DEET
Đối với các ngày đo khác nhau, cần hiệu chỉnh đường chuẩn bằng cách phân tích lại ít nhất 3 trong 6 điểm chuẩn. Tiến hành xử lý mẫu và phân tích HPLC trong điều kiện đã lựa chọn. Tiêm lặp lại mỗi mẫu 3 lần để tính toán giá trị trung bình và RSD.
Kết quả thẩm định độ lặp lại của phương pháp định lượng kem DEET ngày 2
Bằng cách pha loãng dần dung dịch chuẩn DEET và tiến hành phân tích trên hệ thống HPLC. LOD và LOQ của phương pháp được xác định dựa trên xác định tỷ lệ tín hiệu peak / nhiễu đường nền.