MỤC LỤC
Cỏc bản sao này được đưa vào lừi virus ở giai đoạn cuối của quá trình tái bản, mRNA sẽ làm khuôn mẫu cho quá trình phiên mã ngược để tổng hợp cDNA (-) nhờ men reserve transcriptase. Sau đó mRNA bị phân huỷ bởi hoạt tính ribonucleaseH của DNA polymerase, mạch cDNA (-) lại làm khuôn tổng hợp mạch (+), nhưng sự tổng hợp này không hoàn tất trước khi virus trưởng thành.
Trong huyết thanh HBcAg hiện diện như là một thành phần của virus hoàn chỉnh chứ không ở dạng tự do [7]. HBeAg: là loại kháng nguyên hoà tan trong huyết thanh, ở tế bào gan HbeAg hiện diện trong tế bào chất và sẽ được giải phúng khỏi phần lừi của virus khi xử lý chất tẩy mạnh [8].
Việt Nam cũng được xếp vào khu vực lưu hành cao, tuy chưa có những nghiên dịch tễ thống nhất, một số nghiên cứu của chúng ta ở nhiều vùng khác nhau cũng xác định điều này. Tại Hà Nội tỷ lệ người mang HBsAg khoảng từ 15-20%(Hoàng Thuỷ Nguyên,1991), tại trung tâm truyền Máu và Huyết Học ghi nhận 10%; tại Tiền giang 21-28% các nghiên cứu khác cũng cho thấy tỷ lệ mang HBsAg tăng theo lứu tuổi và điều này cũng được ghi nhận ở nhiều địa phương khác như Đồng Tháp, An Giang [7].
Thỉnh thoảng có thể thấy nhiễm HBV ở trẻ em nhưng nhiễm trùng sơ sinh hiếm gặp.
Khi kết quả xét nghiệm về Miễn Dịch, Sinh Hoá và PCR không phát hiện có virus thì xem như đã bình phục Họ không còn lây sang người khác và cũng không cần tiêm ngừa vì cơ thể họ đã được bảo vệ bởi kháng thể [4,7]. Các triệu chứng thường thay đổi theo từng người, thông thường có các triệu chứng sau: vàng da, vàng mắt, biếng ăn, mệt mỏi nhiều, buồn nôn, sốt, nuớc tiểu sậm màu và nổi mẩn đỏ khắp người,.nhưng ở một số người không hề có triệu chứng trên nên họ có thể lây sang người khác.
Truyền máu hoặc các chế phẩm máu nhiễm siêu vi B, tiếp xúc trực tiếp với dịch tiết của bệnh nhân viêm gan B. Các nguyên nhân khác: xăm người, châm cứu, xỏ lỗ taivới vật dụng không được tiệt trùng là nguyên nhân lây truyền virus HBV [7,8].
Đường tình dục: virus gây viêm gan B có thể lây qua hoạt động tình dục cùng giới hoặc khác giới. Ngoại trừ một vài trường hợp bộc phát, các bệnh nhân viêm gan A và E luôn luôn hồi phục hoàn toàn.
Viêm gan mạn được định nghĩa là một sự viêm và hoại tử tế bào gan dai dẳng kéo dài trên 6 tháng. Hai mươi đến ba mươi phần trăm các trường hợp mạn tính sẽ diễn biến và phát triển thành xơ gan.
DNA của virus trong huyết thanh thường đi kèm với sự hiện diện của virus nguyên vẹn, vì vậy việc phát hiện HBV-DNA là một bằng chứng trực tiếp cho biết sự hiện diện của virus trong máu. Trên cơ bản những phương pháp phát hiện HBV-DNA dựa trên việc trực tiếp lai ghép acid nucleic hay dựa trên sự khuyếch đại acid nucleic như trong phản ứng chuoồi Ligase (LCR) hay polymerase chain reaction (PCR).
Tuy nhiên, ý nghĩa của HBeAg như là một chất báo hiệu nhiễm trùng cần được xem xét lại ở những trường hợp mang thể đột biến trước khi tạo lừi của viờm gan B (thể đột biến HBe õm tớnh). Chẩn đoán viêm gan siêu vi mạn dựa vào việc phát hiện virus B và C tồn tại lâu hơn 6 tháng, tức là sự tồn tại của HBsAg (HBV-DNA) trong viêm gan mạn và sự tồn tại của HCV-RNA trong viêm gan C mạn.
Chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi cấp được xác định dựa trên các triệu chứng cơ năng, bệnh cảnh lâm sàng và các xét nghiệm chức năng gan. Do đó xét nghiệm để chuẩn đóan một trường hợp nghi ngờ viêm gan siêu vi gồm có anti-HBV IgM, HBsAg, kháng thể kháng HBc (anti-HBC), và anti-HCV.
DNA của HBV nếu có trong mẫu thử trước hết được làm biến tính để thành các sợi đơn bằng môi trường có pH kiềm hay dùng nhiệt độ cao và được cố định lên màng. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR dựa trên đặc điểm của DNA polymerase; tất cả DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp mạch mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt (primer). Bước 1 : Biến tính (denaturation) nhiệt trong ống nghiệm phản ứng được nâng lên 94 - 950C làm biến tính cấu trúc phân tử DNA, mạch DNA đích được tách ra thành hai mạch đơn.
Bước 3 : Kéo dài (extention), nhiệt độ nâng lên 72 0C là nhiệt độ thích hợp nhất cho enzym DNA polymerase hoạt động tổng hợp mạch mới từ đoạn mồi bổ sung cho mạch khuôn. Sao chu kỳ cuối cùng để hoàn tất phản ứng PCR thường có thêm một giai đoạn gọi là giai đoạn bù (soaking), nhiệt độ được giữ ở 720C trong vòng vài phút hoặc hơn. Đây là giai đoạn mà một số bản sao vì một lý do nào đó trong các giai đoạn sao chép của phản ứng chưa đạt chiều dài đồng bộ so với các bản sao khác, sẽ tiếp tục kéo dài để hoàn tất chiều dài của chuổi DNA.
Phản ứng PCR khuếch đại tối ưu các DNA tinh sạch nhưng nhiều kỹ thuật PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA được tách chiết trực tiếp từ dịch chiết tế bào hay mẫu mô. Nếu sử dụng trong Real-time PCR thì bảo đảm rằng Taq polymerase phải có hoạt tính 5'-3' exonuclease (vì trong quá trình kéo dài luôn bắt đầu từ đầu 5').
Trong khi chạy PCR, đầu đọc realtime sẽ phát hiện các sản phẩm khuếch đại đặc hiệu ở mỗi bước nhiệt độ trong từng chu kỳ nhiệt, tuỳ vào loại màu được cho vào và cơ chế phát hiện màu được thiết kế để phát huỳnh quang. Để phát hiện được DNA trong mẫu người ta thường sử dụng phẩm nhuộm sẽ phát huỳnh quang khi chèn vào sợi đôi DNA (Ethidium bromide, Sybr green)[10] hoặc những probe phát huỳnh quang sẽ phát sáng khi bắt cặp với DNA (TaqMan, Beacons). Trước khi vào các chu kỳ nhiệt của PCR, Sybr Green I phát ít huỳnh quang, khi vào chu kỳ PCR và sau mỗi chu kỳ số lượng sản phẩm khuếch đại tăng lên gấp đôi thì lượng tín hiệu huỳnh quang mà máy thu nhận được cũng tăng lên gấp đôi.
Phản ứng PCR thực hiện có hai bước nhiệt độ: 940C làm biến tính DNA rồi hạ nhiệt độ xuống 600C, lúc này thì probe sẽ tóm bắt và gắn vào một mạch đơn của sợi DNA theo nguyên tắc bổ sung, sau đó hai mồi của phản ứng PCR. Taq Man probe phải phù hợp với điều kiện chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR, chất phát huỳnh quang được chọn reporter phải có phổ phát sáng tách biệt với Quencher và reporter phải phát sáng trong khoảng kích thích của quencher, vì thế quencher phải nằm kề reporter để hấp thụ phổ huỳnh quang. Để xác định được đâu là thời điểm tốt nhất để có kết quả định lượng người ta dựa trên giá trị chu kỳ ngưỡng, và để tính toán được nồng độ DNA trong mẫu ta dựa trên phương trình đường chuẩn phương trình này được xây dựng dựa trên một dãy các nồng độ đã được biết trước thường từ 101-108[2].
Điểm xác định tốt nhất cho quá trình định lượng chính là giá trị của chu kỳ ngưỡng (Ct), nơi mà đường cong cắt đường tín hiệu nền (đường tín hiệu nền là đường giới hạn giá trị đọc thấp nhất của máy). Melt curve dùng xác định chính xác sản phẩm khuếch đại là sản phẩm đích tránh sự nhầm lẩn giữa những sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu hay những tín hiệu được thu nhận từ sợi đơn DNA, hay những mồi bắt cặp, để phát hiện những trường hợp dương tính giả.
Tất cả các mẫu máu được tách lấy huyết thanh trong vòng 4h sau khi lấy máu và được trử ở -700C cho đến khi xử lý và thực hiện phản ứng Real-time PCR. Hoá chất dùng pha Mix cho Realtime-PCR sử dụng đoạn dò Taq Man phát hiện và định lượng HBV-DNA. Trình tự DNA của primer và Probe dựa trên gen S gồm: mồi xuôi(forwar primer), mồi ngược (reverse prime)r, đoạn dò Taq Man(Taq Man probe).
Sử dụng dung dịch rửa để thu được DNA tinh khiết và dùng TE 1x tách DNA ra khỏi silica. Hỳt 900àl L6, 30àl silica cho vào tube rồi hỳt 100àl mẫu bệnh phẩm đã xử lý với ProK-prep, đối với huyết thanh hay huyết tương thì cho trực tiếp vào. Vortex hổn dịch này rồi đem lắc trên máy lắc ngang 100PRM hay lắc tay úp ngửa trong 10 phút.
Sau khi ly trích DNA hoàn tất nếu chưa tiến hành chạy thì lưu trữ các mẫu này ở -200C. Bỳng nhẹ đáy ống nghiệm đã cho bệnh phẩm và chứng vào để trộn đều sau đó ly tâm lắng nhẹ trong 5 giây.