MỤC LỤC
- Phân lập nấm từ mẫu bệnh: Mẫu bệnh được rửa dưới vòi nước chảy, để khô trong phòng thí nghiệm Cắt mẫu thành các miếng nhỏ 5 x 5 mm (bao gồm cả mô bệnh và mô khỏe), Ngâm trong nước javen 2 phút, sau đó rửa bằng cồn 70° trong 1 phút, rửa sạch bằng nước cất vô trùng, làm khô bằng giấy thấm vô trùng rồi đặt vào môi trường PSM Khi tản nấm đã phát triển với kích thước 1 – 2 cm, lấy phần đầu sợi nấm cấy truyền sang môi trường PDA. Dung dịch nấm có mật độ 2 x 105 cfu/ml, nhúng miếng vải màn kích thước 1x1cm vào dung dịch nấm áp lên bề mặt quả, 1 miếng/quả Dùng băng dính đính miếng vải trên bề mặt vỏ Quả đối chứng sử dụng nước cất vô trùng Các quả đã lây nhiễm và đối chứng được đặt trong điều kiện ẩm độ, nhiệt độ 25-280C, trong bóng tối hoàn toàn từ 5 đến 7 ngày Quan sát hàng ngày và ghi nhận, mô tả sự phát triển của bệnh. Lây bệnh cho cây con bằng cách lây trên thân cây và tưới vào gốc cây Cây cam Trưng Vương 12 tháng tuổi ghép trên gốc chấp được trồng trong chậu chứa hỗn hợp đất phù sa, mùn và trấu khử trùng đặt ở nhiệt độ 25-280C, nấm được nhân nuôi trên môi trường PDA Thân cây được khử trùng bằng cồn 700, lật phần vỏ cây đường kính 5mm, áp miếng thạch có chứa nấm 5 ngày tuổi áp lại miếng vỏ (Alvarez và cs 2008) Nhỏ 1 giọt nước cất vô trùng và quấn kín bằng giấy parafilm, bao bằng giấy thiếc để hạn chế sự thoát hơi nước của miếng thạch Dung dịch nấm Phytophthora được tưới vào các cây thí nghiệm, chăm sóc và tưới ẩm hàng ngày bằng máy phun sương Cây đối chứng sử dụng miếng thạch (PDA) không có nấm.
Quả và cây sau khi xuất hiện vết bệnh sẽ được mô tả triệu chứng, tái phân lập nấm So sánh triệu chứng của cây bị bệnh tự nhiên và cây lây bệnh nhân tạo, hình thái nấm từ vết bệnh ngoài tự nhiên và mẫu nấm qua lây bệnh nhân tạo. Thí nghiệm được thực hiện trên môi trường PDA ở 9 mức pH từ 4, đến 8 với khoảng cách 0,5 Điều chỉnh pH trên môi trường bằng 0,1M NaOH hoặc 0,1M HCl Sau khi cấy truyền khoanh nấm, các đĩa petri được đặt trong tủ định ôn ở nhiệt độ 250C trong điều kiện 12h tối/12h sáng Thí nghiệm bao gồm 9 công thức (các mức pH), Mỗi công thức nhắc lại 3 lần mỗi lần 3 đĩa. Theo dừi, xỏc định vi sinh vật đối khỏng trong quỏ trỡnh nuụi, làm thuần cỏc vi sinh vật đối kháng và lưu giữ trên thạch nghiêng trong tủ lạnh Vi sinh vật có hoạt tính đối kháng là vi sinh vật hình thành khuẩn lạc tạo được vòng đối kháng (vòng trong suốt) bao quanh khuẩn lạc.
Khả năng đối kháng nấm Phytophthora của các vi sinh vật trong phòng thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của Wen – Chuan Chung và cs (2011), theo đó miếng khuẩn lạc (0,5mm) nấm bệnh được cấy truyền tại điểm giữa của hộp petri, vi sinh vật đối kháng được cấy đối xứng trong hộp petr, đối chứng không cấy vi sinh vật đối kháng và xác định hoạt tính thông qua kích thước vòng ức chế sau 7-10 ngày theo công thức: H = (Dc – Dt)/Dc x 100, trong đó: Dc là đường kính tản nấm ở công thức đối chứng, Dt là đường kính tản nấm ở công thức cấy vi sinh vật đối kháng. + Phương pháp thực hiện: Bổ sung nguồn các bon (1%) vào môi trường khoáng cơ bản, chia vào các ống nghiệm (5ml) và hấp khử trùng ở 121oC, 30 phút Lấy vi khuẩn hoạt hóa trên môi trường KB bằng que cấy cho vào từng ống nghiệm riêng biệt, mỗi loài vi khuẩn cấy 3 ống, 3 ống đối chứng không cấy vi khuẩn Sau 2-5 ngày nhỏ dung dịch Bromthymol Blue, nếu môi trường chuyển từ màu xanh sang da cam hoặc vàng nhạt là vi khuẩn có khả năng đồng hóa nguồn các bon. + Khả năng đồng hóa nguồn Carbon: Xạ khuẩn được nuôi cấy theo phương pháp chấm điểm và cấy zia trên môi trường ISP-9 có bổ sung 1% các nguồn đường: D-glucose, sacarose, cellulose, mannitol, maltose, glycerol Môi trường ISP-9: (NH4)2SO4 (2,64g);.
Để tìm hiểu cơ chế đối kháng, các vi sinh vật đối kháng tuyển chọn được đánh giá xác định hoạt độ enzym Amylaza, chitinase, β-glucanase và cellulase Phương pháp được tiến hành theo Nguyễn Đức Lượng, (2004) thông qua đường kính vòng phân giải trên môi trường cảm ứng tổng hợp của từng loại enzym. Thí nghiệm diện hẹp gồm 7 công thức, mỗi công thức 5 cây được thực hiện trên cây cam 7 – 8 năm tuổi tại xã Trưng Vương, huyện Hòa An với thuốc trừ nấm sinh học Actinovate 1SP (Streptomyces lydicus WYEC 108), chế phẩm CB-1 và 1 số chế phẩm khác, 3 lần nhắc lại. Ta: Tỷ lệ bệnh (Chỉ số bệnh) ở công thức xử lý sau phun Tb: Tỷ lệ bệnh (Chỉ số bệnh) ở công thức xử lý trước phun Ca: Tỷ lệ bệnh (Chỉ số bệnh) ở công thức đối chứng sau phun Cb: Tỷ lệ bệnh (Chỉ số bệnh) ở công thức đối chứng trước phun.
80g/cây 80g/cây Phương pháp thực hiện: Thuốc được xử lý 2 lần mỗi lần cách nhau 7 ngày Cây thí nghiệm đều nhiễm bệnh ở mức độ nhẹ CSB% khoảng 5-7% Gạt nhẹ lớp đất mặt xung quanh tán và gốc cây để lộ phần rễ, sau đó xử lý nước thuốc vào phần rễ với liều lượng 10 lít/cây. Chỉ tiờu theo dừi: Hiệu lực phũng trừ nấm Phytophthora trong đất vườn cõy cú mỳi của chế phẩm CB-1 theo phương pháp bẫy cánh hoa hồng, sau xử lý 1, 3, 6 tháng, tính hiệu lực phòng trừ theo công thức Henderson Tillton. CT4 – Cắt tỉa + vệ sinh vườn + CB-1 Phương pháp: Cắt tỉa theo quy trình chăm sóc cây ăn quả có múi của viện Bảo vệ thực vật cắt tỉa 04 đợt trong năm gồm sau thu hoạch, vụ xuân, hè và vụ thu Vệ sinh vườn gồm làm cỏ, loại bỏ cây tạp, quét vôi toàn bộ gốc và thân cây.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN