Những yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả phản ứng PCR

Tỉ lệ primer/DNA khuôn mẫu

Một trong những yếu tố quan trọng nhất của PCR là tỉ lệ tối hảo giữa primer DNA mẫu. Nếu tỉ lệ này quá cao, hiện tượng primer-dimer sẽ xuất hiện, giống như. Hầu hết các trường hợp áp dụng PCR, đều dùng một nồng độ primer không quá 0.5μM (12.5 pmol/25 μL phản ứng), không tính đến nồng độ DNA mẫu, để tránh hiện tượng primer-dimer.

Các thành phần khác

Một nồng độ cao của dung dịch đệm PCR được sử dụng để tăng cường hiệu quả cho phản ứng PCR. Sau đây là dung dịch đệm PCR được xem là tốt hơn đối với các đệm đang có mặt trên thị trường.

Các vấn đề thường gặp trong phản ứng PCR và hướng giải quyết 1. Có nhiều sản phẩm không chuyên biệt có kích thước dài hơn

 Nếu mới mua primer mới thì phải kiểm tra lại để đảm bảo độ tin cậy.  Nếu làm như vậy mà thu được sản phẩm (kể cả không đặc hiệu) thì thực hiện như đã trình bày ở trên.  Kiểm tra lại trình tự primer xem có lỗi không và/hoặc tăng chiều dài primer lên 5 nucleotide.

Ưu, nhược điểm của kỹ thuật PCR

• Trong thực nghiệm, kích thước của trình tự cần khuếch đại là giới hạn đầu tiên. Trừ vài trường hợp rất cá biệt, phương pháp PCR không hoạt động được với những đoạn DNA lớn hơn 3 kb. Với những độ dài lớn hơn, điều kiện tối ưu cho phản ứng phải được xác định qua thực nghiệm.

• Sự ngoại nhiễm là vấn đề lớn nhất đặt ra đối với PCR, gắn liền với khả năng khuếch đại bản sao của phương pháp này. Nguồn ngoại nhiễm lớn nhất là các sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước. Khi mở nắp các ống nghiệm sau mỗi lần khuếch đại, các phân tử khuếch đại sẽ thoát ra khỏi ống nghiệm và lơ lửng trong không gian phòng thí nghiệm rồi nhiễm vào các phản ứng tiến hành sau đó.

- Các công đoạn thao tác khác nhau phải tiến hành ở những địa điểm cách xa nhau. - Dụng cụ dùng để thực hiện phản ứng (micropipet không sử dụng vào các thao tác khác. - Dùng tia tử ngoại để loại bỏ các phân tử còn lại từ các lần khuếch đại trước.

- Tất cả mọi thành phần phản ứng đều chia thành những lượng nhỏ đủ với 1,2 lần thao tác. Sự sao chép bởi Taq polymerase cho tỉ lệ sai sót khá cao (10-4, nghĩa là cứ 10000 nucleotid thì enzyme gắn sai một nucleotid).

Giới thiệu phương pháp phân tích trình tự DNA

Ta không thể loại bỏ hoàn toàn các sai sót này mà chỉ có thể gảm bớt. Đó là camera có tên kỹ thuật CCD, viết tắt từ chữ “chatge- couple-device” (Bùi Chí Bửu-Nguyễn Thị Lang, 2000). Có hai hóa chất trong máy ABI, đó là primer nhuộm màu (dye primer) và terminator nhuộm màu.

Ở đề tài này chúng tôi sử dụng dye primer, màu nhuộm huỳnh quang gắn dính trong primer (Smith và ctv,1986). Phương pháp dye primer có ưu điểm là tín hiệu ghi nhận được rất đồng nhất. Kỹ thuật phân tích trình tự trực tiếp đối với sản phẩm PCR là một cải tiến kỹ thuật rất quan trọng trong phân tích genome.

Theo phương pháp này, chúng ta có thể biết được đặc điểm của sequence mà mình nghiên cứu một cách nhanh chóng, không cần phải xây dựng một kho lưu trữ clone, hoặc thanh lọc các clone.

Giới thiệu về microsatellite 1.Khái niệm về microsatellite

• Các phương pháp phát hiện microsatellite
• Nguyên tắc phát hiện microsatellite bằng primer PCR

Như một trình tự mang mã, microsatellite đã được tìm thấy biểu hiện ở rất nhiều protein và sự khác nhau về số lần lặp lại của các trình tự trong microsatellite có thể dẫn đến sự khác nhau về chức năng của protein và hoạt động của gen, do đó có thể ảnh hưởng đến chức năng sinh lý cũng như sự phát triển của cơ thể. Những tính chất đặc biệt của microsatellite như sự đột biến điểm dẫn đến những giả thiết cho rằng microsatellite có thể là một nguồn chủ yếu tạo nên sự đa dạng về di truyền số lượng và quá trình tiến hóa thích nghi (Kashi và ctv.,1990,1997). Khi kích thích bởi tia laser, các chất nhuộm màu này giải phóng ra một tín hiệu mà máy tính có thể phát hiện được bằng cách so sánh sự di chuyển của sản phẩm PCR với DNA chuẩn, chúng ta có thể có kích thước chính xác của đoạn DNA quan tâm.

Vì vậy, dựa vào kích thước của sản phẩm PCR chúng ta có thể tính được số lần lặp lại của dinucleotide “CA” trong mỗi trình tự microsatellite (như trong ví dụ này “CA” có 8 lần lặp lại với chiều dài sản phẩm PCR là 116bp). Sự xuất hiện của band phụ là do quá trình trượt lỗi của DNA polymerase (Tautz,1989), band phụ có thể gây trở ngại cho việc xác định kích thước chính xác của band chính, nhưng band phụ cũng có thể được xem như 1 dấu hiệu để nhận biết sản phẩm khuếch đại đúng là microsatellite. Khả năng sử dụng cùng loại primer microsatellite giữa các loài khác nhau phụ thuộc vào sự di truyền ổn định của trình tự microsatellite và mức độ bảo tồn (hay giống nhau) của vùng flanking (nằm ở 2 bên trình tự microsatellite) trong quá trình tiến hóa của loài.

Nếu chúng ta muốn áp dụng phương pháp microsatellite để nghiên cứu di truyền ở một loài nào đó thì trước tiên hãy thử áp dụng phân tích với primer microsatellite của những loài có quan hệ di truyền gần gũi với loài đó. - Powell và ctv., (1996) đã tiến hành thí nghiệm kiểm tra hiệu quả của các loại marker di truyền RFLP, RAPD, AFLP và Microsatellite trong phân tích di truyền trên cây đậu tương thông qua 2 chỉ tiêu: phân tích mức độ dị hợp và tỉ số multiplex (số loci phân tích được trong một lần thí nghiệm). - Hạn chế của phương pháp microsatellite là không thể áp dụng phân tích trên một hệ thống lớn bao gồm nhiều loài có quan hệ di truyền xa nhau, điều này là do microsatellite có tỉ lệ đột biến quá cao dẫn đến 2 trở ngại.

Thứ hai, do tỉ lệ đột biến cao nên khi 2 loài có cùng kết quả phân tích với 1 trình tự microsatellite, ví dụ như AC19, chúng ta cũng không thể kết luận rằng 2 loài đó có cùng nguồn gốc tổ tiên ban đầu, vì có thể 1 loài phân ly từ tổ tiên của chúng là AC18 rồi đột biến thành AC19, còn 1 loài phân ly từ tổ tiên của chúng là AC20 rồi đột biến thành AC19. Việc ứng dụng microsatellite trong nghiên cứu di truyền ở cây trồng mới được thực hiện trong khoảng thời gian gần đây nhưng kết quả ứng dụng rất thành công do mức độ đa hình phát hiện bởi microsatellite cao hơn bất kỳ marker phân tử nào khác (Saghai Maroof và ctv.,1994; Powell và ctv., 1996). Mặc dù tần số microsatellite trên DNA tế bào thực vật thấp hơn động vật (Wang và ctv., 1994) nhưng các trình tự microsatellite có trong DNA lục lạp là nguồn marker rất hữu ích trong nghiên cứu tính đa hình, được áp dụng để phân loại 13 dòng Glycine (Powell và ctv., 1995).

Nhờ những tính chất của một marker, microsatellite được áp dụng trong nhiều lĩnh vực như: lập bản đồ gen, nghiên cứu những gen liên quan đến bệnh di truyền, giám định pháp y, phân tích để tìm ra bố mẹ, xác định phả hệ, xác định cấu trúc quần thể, đặc biệt là áp dụng trong việc xác định cấu trúc và liên kết giữa các cá thể, cấu trúc quần thể của các loài có nguy cơ bị thu hẹp hoặc phát triển, xác định mức độ đồng huyết của quần thể, xác định các vị trí liên quan đến tính trạng số lượng (QTL)…Các thông tin về microsatellite đa al của một locus cũng như trên nhiều locus có thể được phân tích bằng các phương pháp thống kê để đưa ra nhiều thông tin bổ ích về cấu trúc quần thể, phả hệ, các gen liên quan đến năng suất và chất lượng sản phẩm, gen chống bệnh,v.v.

Các công trình nghiên cứu có liên quan