Tuyển chọn chủng Bacillus có hoạt tính protease kiềm ứng dụng trong sản xuất từ bột đậu tương

Tính chất, đặc điểm của protease

Tuy nhiên sự phân loại này chỉ có ý nghĩa thực dụng không thật sự chính xác vì pH hoạt động tối thích của mỗi enzyme còn phụ thuộc vào bản chất cơ chất và nhiều yếu tố khác nữa [7]. Muốn phân giải protein cũng như đối với các hợp chất cao phân tử khác, đầu tiên vi sinh vật phải tiết ra các enzyme phân giải protein ngoại bào và làm chuyển hóa protein thành các hợp chất có phân tử lượng nhỏ hơn (các polypeptid và các olygopeptid). Một phần các axit amin này được các vi sinh vật sử dụng trong quá trình tổng hợp protein của chúng, một phần khác được tiếp tục phân giải theo những con đường khác để sinh ra NH3, CO2 và những sản phẩm trung gian khác.

Ứng dụng của protease

Phương pháp làm mềm thịt nhờ tác dụng của protease cho phép nâng cao chất lượng thịt đưa vào chế biến, làm tăng tỷ lệ thịt có thể đưa vào sản xuất và rút ngắn thời gian chín của thịt nhiều lần. Người ta cũng dùng protease để sản xuất dịch đạm thủy phân từ các phế liệu giàu protein như thịt vụn, da… Người ta sử dụng dịch đạm thủy phân làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm và bổ sung vào thức ăn gia súc. Trong số các enzyme này, rennin là enzyme có giá trị đặc biệt, cho phép thu được sản phẩm có chất lượng cao nhất còn các protease vi sinh vật thì ngoài khả năng làm đông tụ sữa còn có khả năng thủy phân sâu sắc cazein, gây ảnh hưởng xấu đến mùi vị của phomat.

Tình hình nghiên cứu và ứng dụng protease trong sản xuất ở Việt Nam

 Trong hương phẩm và mỹ phẩm: dưới tác dụng của protease trong kem, các biểu b́ của da đã chết được tách ra, da non sẽ xuất hiện trên bề mặt, đồng thời sự phát triển lông (tóc) cũng chậm lại.  Trong công nghiệp y học: các chế phẩm protease cũng được sử dụng để sản xuất các môi trường dinh dưỡng hỗn hợp có protein dùng trong nuôi cấy vi khuẩn và các vi sinh vật khác. Do đó, phải thủy phân sơ bộ các protein bằng protease để cô đặc và tinh khiết các huyết thanh kháng độc để chữa bệnh (huyết thanh kháng độc) [8].

Vật liệu 1.Thiết bị

Các hóa chất phòng Vi sinh vật – Viện sinh học Nông nghiệp – Trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội.

Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Đối với môi trường có agar cần được đun sôi quấy đều sau đó đem thanh trùng. Môi trường được thanh trùng trong điều kiện: áp suất 1 atm ở nhiệt độ 1210C trong 30 phút.

Các phương pháp nghiên cứu 1. Phương pháp phân lập

• Một số phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn Các chủng được quan sát trên môi trường NA bằng mắt thường, và

Tiếp theo, dùng que cấy vô trùng lấy dịch vi khuẩn phân lập đã được pha loãng bằng nước cất vô trùng, và cấy zich zắc trên bề mặt thạch nghiêng. Một số phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn Các chủng được quan sát trên môi trường NA bằng mắt thường, và kính hiển vi quang học. Cách tiến hành: Lấy một phiến kính khô và sạch đặt lên giá đỡ, nhỏ một giọt nước sạch vô trùng lên giữa phiến kính, dùng que cấy lấy một ít vi sinh vật mọc trên môi trường đặc, đặt vào chỗ giọt nước trên phiến kính, hòa nhẹ để tạo huyền phù.

Nguyên tắc: Sự bắt màu thuốc nhuộm của tế bào vi sinh vật là một quá trình hấp phụ, khả năng bắt màu của tế bào vi sinh vật có liên quan đến muối magie của axit ribonucleic. Nhỏ một giọt dung dịch H2O2 nồng độ 10% lên phiến kính, dùng đầu que cấy lấy một ít vi khuẩn mới hoạt hóa (24 giờ) trộn vào giọt H2O2 trên phiến kính. Do vi sinh vật trong phần lớn trường hợp là không có màu và hầu như trong suốt, vì vậy dịch nuôi cấy của tế bào hấp phụ ánh sáng không đáng kể trong vùng quang phổ ánh sáng thấy được.

Nên trong cùng một chiều dài sóng ánh sáng đập vào mà sự tán xạ ánh sáng càng nhiều nghĩa là môi trường càng đục tương đương với mật độ tế bào vi sinh vật càng nhiều. Để xác định khả năng thủy phân tinh bột, protein của các chủng vi khuẩn, chúng tôi tiến hành thử sơ bộ theo phương pháp đục lỗ trên đĩa thạch. Chờ cho môi trường nguội và đông lại, sau đó dùng khuyên đục lỗ (đường kính khoảng 1cm) đã được khử trùng để đục lỗ trên bề mặt môi trường tạo thành các giếng.

Phương pháp này không cho phép xác định chính xác hoạt độ của các enzyme amylase, protease, nhưng cho phép định tính sự có mặt của các enzyme này nhanh và đơn giản.

Phân lập chủng Bacillus

Từ cỏ khô và đất phân lập được chủng kí hiệu là Bs và Bm Từ khoai tây và đất phân lập được chủng kí hiệu là BM 3.2. Các khuẩn lạc được làm sạch thuần khiết bằng cách cấy phân lập và cấy lại nhiều lần. Sau đó đem quan sát thấy các khuẩn lạc có hình dạng khác nhau: Chủng Bs khuẩn lạc tròn, màu trắng đục, mép nhăn, tạo thành màng mịn lan trên bề mặt thạch, đường kính 2 – 3mm.

Chủng BM khuẩn lạc màu xám nhạt, không lan ra môi trường, đường kính 2 – 3 mm.

Đặc điểm hình thái tế bào

Khi nhuộm Gram quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần, nhận thấy cả 3 chủng đều bắt màu tím, tức cả 3 chủng đều là vi khuẩn Gram dương. Qua nghiên cứu hình thái khuẩn lạc và tế bào chúng tôi sơ bộ bước đầu định tên cho 3 chủng này như sau: Bs – Bacillus subtilis, Bm – Bacillus megatherium, BM – Bacillus mesentericus.

Ảnh hưởng của nồng độ oxy hòa tan

Như vậy CaCO3 có vai trò điều chỉnh pH của môi trường, làm cho pH của môi trường nằm trong vùng hoạt động tối thích của chủng vi khuẩn Bacillus, làm cho chủng vi khuẩn Bacillus sinh trưởng và sinh enzyme tốt hơn. Trong các thí nghiệm đối với các độ hiếu khí khác nhau, cả 3 chủng đều dao động. Trong các thí nghiệm đối với các độ hiếu khí khác nhau, cả 3 chủng đều dao động.

Trên môi trường có bổ sung CaCO3 mật độ tế bào thể hiện rất cao và đều hơn ở 3 chủng. Trên môi trường có bổ sung CaCO3 mật độ tế bào thể hiện rất cao và đều hơn ở 3 chủng. Xác định hoạt tính enzyme của các chủng ở các độ thông khí khác nhan trên môi trường có cơ chất cảm ứng bằng phương pháp đục lỗ thạch.

Từ hai hình 3.20 và 3.21 chúng tôi nhận thấy hoạt tính enzyme thể hiện càng cao ở độ hiếu khí càng lớn.

Nghiên cứu ảnh hưởng của pH tới sự sinh trưởng và phát triển của ba chủng nghiên cứu

Như vậy pH ban đầu thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của cả ba chủng là từ 7 – 8.

Nghiên cứu sử dụng bột đậu tương làm nguồn nguyên liệu thay thế

Từ bảng trên chúng tôi nhận thấy nồng độ bột đậu tương mà tại đó 3 chủng nghiên cứu cho hoạt tính enzyme cao nhất là 3% tức là 30 g/lít môi trường. Hoạt tính amylaza đạt cực đại ở nồng độ CaCO3 3% đối với cả 3 chủng Bs, Bm và BM. Hoạt tính 2 enzyme đều thể hiện cao hơn ở môi trường chỉ có bột đậu tương.

Tuy vậy CaCO3 ở nồng độ cao sẽ ức chế quá trình sinh enzyme của cả 3 chủng. Cũng qua bảng trên chúng tôi nhận thấy chủng vi khuẩn Bs là có hoạt tính mạnh nhất, thích hợp nhất với bột đậu tương. Vì vậy bột đậu tương đóng vai trò là chất cảm ứng của hai enzyme amylaza và proteaza.

Kết quả thí nghiệm cho thấy trên môi trường có bột đậu tương thì sự sinh trưởng và biểu hiện hoạt tính 2 enzyme amylaza và proteaza là lớn nhất. Nuôi Bs, Bm và BM trên môi trường (thành phần dưới đây cho 1 lít môi trường) sẽ thu được cả hai enzyme amylaza và proteaza. Trong thực tế sản xuất công nghiệp chúng ta có thể dùng bột đậu tương làm nguồn nguyên liệu cơ bản để sản xuất enzyme.