Thực trạng phát triển cây điều tại tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu và tiềm năng xuất khẩu
MỤC LỤC
Tình hình canh tác cây điều của tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu
Bà Rịa – Vũng Tàu là tỉnh mới thành lập năm 1991, thế mạnh là công nghiệp dầu khí và du lịch, ngoài ra còn phát triển mạnh cây công nghiệp như cao su, cà phê, tiêu, điều, đem lại nguồn thu nhập khá cao, chủ yếu là cho các huyện của tỉnh. Trong những năm gần đây đang phát triển mạnh cây điều cao sản cho năng suất cao và ổn định hơn so với các giống điều địa phương. Đất nông nghiệp của tỉnh khá màu mỡ, có diện tích đất đỏ bazan lớn, cùng với điều kiện khí hậu khá ổn định, nhiệt độ trung bình trong năm là 24oC – 28oC, có mùa khô và mùa mưa phân biệt, hệ thống thủy lợi phát triển và rộng khắp,…là những điều kiện thuận lợi cho phát triển cây điều.
Nói chung, giá trị đóng góp của các loại nông sản vào tổng thu nhập của toàn tỉnh không nhiều, song có một vai trò quan trọng trong sự phát triển chung của tỉnh, góp. Với những vùng đất khô cằn, bạc màu thì cây điều là giải pháp thích hợp nhất để giúp bà con có được thu nhập cao. Tỉnh chủ trương đến năm 2010 thay thế dần các giống điều địa phương, trồng lâu năm, cho năng suất không cao, không ổn định bằng các giống điều cao sản cho năng suất cao, ổn định, kháng sâu bệnh và chất lượng đồng đều, phấn đấu đến năm 2010 đạt 16.000 tấn/năm (Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn tỉnh BR – VT).
Các kỹ thuật đánh giá tính đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử 1. Giới thiệu chung về tính đa dạng di truyền và chỉ thị phân tử
- Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
- Kỹ thuật AFLP
- Kỹ thuật PCR
Đây là kỹ thuật sinh học phân tử nhằm phát hiện sự khác nhau về di truyền giữa các cá thể, giữa các giống trong cùng một loài dựa vào sự khác nhau về số lượng và kích thước của những đoạn DNA được tạo ra do sử dụng những enzyme cắt giới hạn (restriction enzymes) cắt toàn bộ bộ gene của những cá thể hay giống được nghiên cứu, sau đó những đoạn DNA được cắt ra này được lai với những probe được đánh dấu huỳnh quang đã biết, kết quả được quan sát qua màu huỳnh quang phát ra. Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý: Giữa những giống khác nhau có một đoạn DNA ổn định và chuyên biệt có trình tự đơn giản gồm khoảng 2 – 6 nucleotides được lặp lại nhiều lần (simple sequence repeat), tiến hành phản ứng PCR sử dụng các primer chuyên biệt nhân bản đoạn DNA chuyên biệt này lên. Không giống như kỹ thuật RAPD sử dụng những primer ngắn và nhân bản một cách ngẫu nhiên, cho kết quả có độ tin cậy không cao, kỹ thuật AFLP sử dụng 2 primer dài, cho kết quả đáng tin cậy và ổn định (kết quả giống nhau khi được lập lại nhiều lần) do điều kiện thực hiện 2 phản ứng PCR nghiêm ngặt.
Việc chọn lựa một kỹ thuật sinh học phân tử để sử dụng phải căn cứ vào nhiều yếu tố, cụ thể như những ưu và khuyết điểm của kỹ thuật đó hay tùy thuộc vào tình hình nghiên cứu thực tế, tuy nhiên các kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử có thể được so sánh một cách tương đối theo những tiêu chí như bảng 2.9. Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) là phản ứng nhân bản nhanh chóng một chuỗi DNA khuôn thành hàng triệu bản giống hệt nhau và giống hệt chuỗi DNA khuôn qua vài chục chu kỳ nhiệt độ luân chuyển liên tục, sử dụng các primer bắt cặp bổ sung với chuỗi DNA khuôn, enzyme polymerase gắn các dNTPs vào với nhau theo một trình tự bổ xung với trình tự của chuỗi DNA khuôn, bắt đầu từ đầu 3’ của các primer [1] [5] [6] [8] [10] [11] [12] [14]. Phản ứng PCR được tiến hành với sự hiện diện của: đoạn DNA khuôn (DNA template), các dNTPs, enzyme polymerase, các primer, MgCl2, dung dịch đệm (buffer) và máy thermocycler – máy điều khiển chu kỳ nhiệt độ, thực hiện duy trì và luân chuyển nhiệt độ của từng giai đoạn một cách chính xác và ổn định trong một khoảng thời gian chính xác trong 30 – 45 chu kỳ.
Nguyên lý kỹ thuật PCR
45 chu kỳ
Nếu như nồng độ enzyme Taq polymerase quá cao có thể làm phát sinh những sản phẩm không đặc hiệu, còn nếu nồng độ enzyme Taq polymerase quá thấp thì phản ứng không xảy ra hoàn toàn do không có đủ enzyme. Ban đầu thiết lập một giai đoạn nhiệt độ khoảng 94oC trong 5 phút để hầu như tất cả các đoạn DNA khuôn mạch đôi bị biến tính tách ra thành 2 DNA khuôn mạch đơn phân biệt và không tự bắt cặp lại với nhau. Nhiệt độ biến tính: 94oC – 96oC trong 15 giây hay lâu hơn, các sản phẩm của chu kỳ PCR trước tiếp tục bị làm biến tính để thành DNA khuôn mạch đơn cho chu kỳ PCR tiếp theo.
Nhiệt độ bắt cặp là quan trọng nhất, bảo đảm rằng không quá thấp (do dẫn đến bắt cặp không đặc hiệu) và cũng không quá cao (dẫn đến khó bắt cặp hoàn toàn hay không bắt cặp). Thời gian kéo dài phải đủ để có thể kéo dài hoàn toàn một trình tự và hầu hết các đoạn DNA khuôn mạch đơn, nếu không sẽ dẫn đến những kết quả sai lầm do không đủ thời gian để nối dài. Trong quá trình thực hiện phản ứng PCR trên DNA của nhiều loại sinh vật khác nhau các nhà khoa học cần phải tối ưu hóa các điều kiện cho phản ứng PCR bởi mỗi loại sinh vật có một đặc trưng riêng.
Mục đích của việc thiết kế primer là có được sự cân bằng giữa sự chuyên tính (bắt cặp hoàn toàn bổ xung giữa những nucleotide của primer với những nucleotide của DNA template) và hiệu quả của PCR (tạo ra càng nhiều sản phẩm gần với lý thuyết tính toán càng tốt). Trình tự của primer xác định kích thước, vị trí của sản phẩm PCR và nhiệt độ Tm, giúp ước lượng được nhiệt độ bắt cặp khoảng Tm – 2 (thường chỉ đúng với những primer có chiều dài nhỏ hơn 20 basepairs). Với A, T, G, C là số lượng các nucleotide tương ứng có trong chuỗi primer, tuy nhiên công thức này chỉ để tham khảo hay ước lượng.
Nồng độ MgCl2: ảnh hưởng lớn đến kết quả phản ứng, người ta thường thay đổi nồng độ của MgCl2 trước tiên để phản ứng xảy ra dễ dàng hơn. Những enzyme DNA polymerase chịu nhiệt: Nên sử dụng ở nồng độ 0,5 U/25 μl đủ để kiểm soát sự đặc hiệu của phản ứng PCR. Nồng độ các primer: pimer F (forward primer) và primer R (reverse primer) phải có nồng độ bằng nhau và không nên dư thừa.
Tỉ lệ primer/DNA template: Nếu tỉ lệ này quá cao, hiện tượng dimer – primer sẽ xuất hiện do lượng DNA template thấp và lượng primer quá cao.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu
- Nguyên liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 1. Nguyên liệu
- Hóa chất cần thiết
- Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
Bộ Taq polymerase (Biorad) và Taq polymerase (ABgene) gồm: Taq polymerase, MgCl2 và Taq buffer.
Phương pháp nghiên cứu 1. Phần thu thập mẫu
- Phần nghiên cứu và phân tích trong phòng thí nghiệm Trong phòng thí nghiệm chúng tôi tiến hành những công việc
Sau khi chọn được cây điều có những đặc điểm nổi bật đáng quan tâm, chúng tôi tiến hành lấy mẫu lá. Sau đó mẫu được giữ trong ngăn đá tủ lạnh và sau vài ngày chúng tôi đem mẫu giữ ở tủ –20oC tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hoá Sinh thuộc Trường Đại học Nông Lâm Tp. Thực hiện tách chiết và kiểm tra DNA của các mẫu lá điều thu thập được.
Phương pháp tách chiết: Tách chiết DNA dựa trên phương pháp của Doyle và Doyle (1988). Phương pháp đo mật độ quang phổ: Phương pháp này cho phép ước lượng tương đối chính xác lượng DNA cũng như chất lượng DNA có trong mẫu kết. Phương pháp điện di: Phương pháp này cho phép ta đánh giá chất lượng DNA (có bị gãy nhiều hay không, có bẩn không,…) tuy nhiên không cho biết nồng độ của DNA thu được hay độ sạch của dung dịch DNA một cách chính xác.
Thí nghiệm 1: Thực hiện theo quy trình do Samal và ctv (2003) đưa ra, thành phần hỗn hợp phản ứng và chu trình nhiệt độ của thí nghiệm 1 được trình bày trong bảng 3.4. Thí nghiệm 4: Chúng tôi thực hiện 6 nghiệm thức thay đổi nồng độ các thành phần tham gia phản ứng (được trình bày trong bảng 3.7), đồng thời giữ nguyên chu trình phản ứng như thí nghiệm 3. Kiểm tra phản ứng cắt DNA của enzyme: Sau khi có được DNA, bước đầu tiên là kiểm tra xem những enzyme cắt EcoRІ và MseІ có phù hợp với bộ gene đó hay không.
Nhân bản chọn lọc: Để thực hiện bước này chúng tôi tiến hành chọn những tổ hợp primer EcoRI – MseI. Sau khi thực hiện phản ứng nhân bản chọn lọc xong, sản phẩm được điện di trên máy giải trình tự. Điện di: Kết quả phản ứng nhân bản chọn lọc được điện di trên máy giải trình tự AB sequencer 3100.
