Đánh giá tác dụng điều hòa lipid máu của viên nang cứng Ngưu tất - Đan sâm - Tam thất trên thực nghiệm
MỤC LỤC
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Định lượng: Hàm lượng acid oleanolic trong 1 g chế phẩm không dưới 1 mg tính theo chế phẩm khô kiệt, hàm lượng acid salvianolic B trong 1 g chế phẩm không dưới 1 mg tính theo chế phẩm khô kiệt và hàm lượng ginsenosid Rg1 trong 1 g chế phẩm không dưới 1 mg tính theo chế phẩm khô kiệt. Phương pháp xác định độc tính bán trường diễn của viên MIX trên chuột nhắt trắng bằng đường uống được tiến hành theo hướng dẫn của Tổ chức Y tế thế giới về thuốc có nguồn gốc từ thảo dược,113 và tham khảo hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu của Bộ Y tế.115. Phương pháp tạo dịch đồng thể enzyme từ gan chuột nhắt trắng bình thường Tạo dịch đồng thể enzyme từ gan chuột nhắt trắng được thực hiện theo phương pháp của Patel HD và cộng sự,52 với một số thay đổi cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm của Trương Đình Phước và cộng sự.116.
KẾT QUẢ
Bào chế và tiêu chuẩn cơ sở viên MIX 1. Bào chế viên MIX
Sắc ký đồ định tính sự hiện diện của acid oleanolic trong viên MIX Quan sát sắc ký đồ (Hình 3.3) cho thấy, mẫu thử viên MIX có vết có màu tím và giá trị Rf = 0,63 tương đồng với chuẩn acid oleanolic khi phát hiện bằng thuốc thử H2SO4 10% trong ethanol. Sắc ký đồ định tính sự hiện diện của ginsenosid Rg1 trong viên MIX Quan sát sắc ký đồ (Hình 3.5) cho thấy, mẫu thử viên MIX có vết có màu tím và giá trị Rf = 0,69 tương đồng với chuẩn ginsenosid Rg1 khi phát hiện bằng thuốc thử H2SO4 10% trong ethanol. Kết quả thẩm định quy trình định lượng đồng thời hàm lượng acid oleanolic, acid salvianolic B và ginsenosid Rg1 trong viên MIX bằng phương pháp HPLC nêu trên cho thấy độ tin cậy cao từ cách xử lý mẫu đến điều kiện phân tích, đảm bảo tính đặc hiệu, tính tương thích hệ thống, khoảng tuyến tính, độ chính xác, độ đúng.
Tính an toàn của viên MIX trên chuột nhắt trắng 1. Độc tính cấp
Như vậy, căn cứ vào kết quả kiểm nghiệm xác định được tuổi thọ của chế phẩm viên MIX là 24 tháng và đề nghị hạn sử dụng là 24 tháng cho chế phẩm này. Trọng lượng cơ thể chuột của lô chứng uống nước cất và lô thử uống viên MIX liều 4 viên/kg ở thời điểm sau 1 và 2 tháng đều có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với trước thử nghiệm (P < 0,05). Ở thời điểm sau 2 tháng, trọng lượng cơ thể chuột ở lô thử uống viên MIX tăng có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý (P < 0,05).
BÀN LUẬN
Bào chế và tiêu chuẩn cơ sở viên MIX 1. Bào chế viên MIX
Nghiên cứu lựa chọn phương pháp ngấm kiệt vì: Phương pháp này hiện đang được sử dụng khá phổ biến trong các phòng thí nghiệm, mang lại hiệu suất chiết khá cao, có thể ứng dụng trong thực tế sản xuất với quy mô công nghiệp và đây cũng là phương pháp chiết saponin từ dược liệu được sử dụng nhiều so với các phương pháp khác.119,120. Nghiên cứu lựa chọn dạng bào chế cho công thức kết hợp Ngưu tất - Đan sâm - Tam thất là dạng viên nang cứng dùng để uống vì những ưu điểm: Che dấu được mùi vị hơi đắng, chát của dược chất (cao khô MIX), bảo vệ dược chất tránh những tác động bất lợi của môi trường, hình dạng thuôn, bề mặt trơn bóng nên dễ nuốt, tiện sử dụng, có thể sản xuất ở những quy mô khác nhau, tính sinh khả dụng cao (công. thức bào chế đơn giản, ít sử dụng tá dược, ít tác động của kỹ thuật bào chế) so với viên nén.112. Hiện nay, một hoặc hai chất đánh dấu sinh học hoặc hoạt chất có tác dụng dược lý trong thảo dược hoặc hỗn hợp thảo dược đang được ứng dụng để đánh giá tính xác thực và chất lượng của thuốc thảo dược.123 Các nghiên cứu về hóa thực vật đã phân lập và xác định hợp chất chính của Ngưu tất là acid oleanolic74,79; Đan sâm là tanshinon IIA, acid salvianolic A, acid salvianolic B82-84; Tam thất là ginsenosid Rg1, G-Rb1, notoginsenosid.33,34,38 Các hợp chất này cũng đã được chứng minh có tác dụng hạ lipid máu, hạ đường huyết, chống đông máu, kháng viêm, tăng cường miễn dịch, bảo vệ gan.
Tính an toàn của viên MIX trên chuột nhắt trắng
Nghiên cứu sử dụng chuột nhắt trắng đực làm động vật thí nghiệm để đánh giá tính an toàn của viên MIX vì: (1) Chuột nhắt trắng có tính tương đồng về di truyền với người tương đối cao, nhỏ, khá vô hại, dễ chăm sóc và nuôi dưỡng, vòng đời ngắn; (2) chuột nhắt trắng đực dễ mua, chi phí thấp hơn; (3) chuột thí nghiệm từ 4 - 6 tuần tuổi đang trong giai đoạn phát triển để chuyển sang giai đoạn trưởng thành, trong các thí nghiệm cần thời gian dài (độc tính bán trường diễn) nếu nuôi chung chuột đực và cái, chuột cái sẽ giao phối và sinh sản, phần nào ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu. Theo hướng dẫn thử nghiệm độc tính bán trường diễn thuốc có nguồn gốc từ thảo dược của WHO,113 hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu của Bộ Y tế.115 Trường hợp mẫu thử không thể hiện độc tính cấp hoặc rất ít độc có thể thử độc tính bán trường diễn trên một loài động vật (gặm nhấm).Căn cứ vào kết quả thử nghiệm, viên MIX không thể hiện độc tính cấp, do đó, có thể tiến hành thử nghiệm độc tính bán trường diễn của viên MIX trên một loài động vật, cụ thể là chuột nhắt trắng. Theo WHO, đánh giá được càng nhiều các thông số của máu càng có khả năng đánh giá chính xác độc tính của thuốc.113 Vì vậy, nghiên cứu tiến hành định lượng các thành phần của máu gồm: Số lượng hồng cầu, Hb, Hct, MCV, MCH, MCHC, số lượng bạch cầu và số lượng tiểu cầu, kết quả thử nghiệm cho thấy số lượng hồng cầu, nồng độ Hb, Hct, số lượng bạch cầu, số lượng tiểu cầu cả 2 lô tại thời điểm sau 1 tháng và 2 tháng tăng có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với trước thử nghiệm.
Tác dụng điều hòa lipid máu của viên MIX trên chuột nhắt trắng
So với mô hình gây RLLM nội sinh bằng tyloxapol, mô hình gây RLLM ngoại sinh bằng chế độ ăn giàu lipid có sự thay đổi nồng độ các thành phần lipid máu ít điển hình hơn (đặt biệt là nồng độ TG) điều này có thể được giải thích: Tyloxapol ngoài tác dụng tăng hoạt tính HMG-CoA reductase (làm tăng tổng hợp cholesterol), còn có tác dụng giảm hoạt tính LPL (làm giảm chuyển hóa CM và VLDL), vỡ vậy, làm thay đổi rừ rệt nồng độ cỏc thành phần lipid mỏu (tăng TC, giảm HDL-C, tăng LDL-C và TG). Acid oleanolic đã được chứng minh tác dụng hạ lipid máu, hạ đường huyết, chống oxy hóa, chống viêm, bảo vệ tế bào gan, tế bào cơ tim, tế bào thần kinh, tăng cường miễn dịch, chống ung thư …124,125,142 Acid oleanolic ức chế LXR-α làm giảm hấp thu cholesterol ở ruột, tăng cường vận chuyển lượng cholesterol dư thừa từ ngoại biên về lại gan, tăng chuyển hóa cholesterol thành acid mật và tăng bài tiết mật, vì vậy, làm giảm cholesterol máu.109,110 Ginsenosid Rg1 làm giảm nồng độ TC, TG máu trên thực nghiệm thông qua các tác động: Ginsenosid Rg1 có tác dụng tăng hoạt tính PPAR-α làm tăng quá trình oxy hóa FA, do đó, làm giảm TG; Ginsenosid Rg1 tăng hoạt tính CYP-7A1 làm tăng chuyển hóa cholesterol thành acid mật, làm giảm cholesterol máu;. Ngoài ra, nồng độ TC, TG trong gan cũng giảm đáng kể.26 Hoạt chất dihydrotanshinon I chiết xuất từ Đan sâm có tác dụng ức chế CETP làm giảm TC, LDL-C, TG, tăng HDL-C, apo-A1 trong máu và gan chuột.27 Dịch chiết từ Đan sâm làm tăng hoạt tính enzyme CYP7A1, làm tăng chuyển hóa cholesterol tự do thành acid mật và tăng bài tiết mật, làm giảm cholesterol máu.107 Dịch chiết Đan sâm có tác dụng tăng LDL-R trên màng tế bào gan, làm tăng sự hấp thu LDL-C vào gan, do đó, làm giảm nồng độ cholesterol máu.107.
Tác dụng theo YHCT của viên MIX
Khi chức năng sơ tiết của can bị rối loạn làm ảnh hưởng đến chức năng vận hóa của tạng tỳ, kiến cho thủy thấp không được vận hành tích tụ lại mà sinh đàm thấp.50 Theo lý luận YHCT viên MIX có tác dụng: (1) hoạt huyết hóa ứ làm cho khí huyết lưu thông, kinh mạch thông thoáng sẽ cải thiện các triệu chứng bệnh “Tiêu”; (2) bổ can thận sẽ góp phần giải quyết được gốc của bệnh “Bản”, từ đó sẽ tác động đến đàm thấp, huyết ứ. Hy vọng trong tương lai, viên MIX sẽ là một lựa chọn thích hợp cho bệnh nhân có nồng độ các thành phần lipid máu không quá cao, bệnh nhân RLLM có bệnh lý gan, thận đi kèm hoặc có thể kết hợp với thuốc hạ lipid máu khác để tăng đạt mục tiêu điều trị và khắc phục tác dụng bất lợi của thuốc kết hợp. Tổng hợp kết quả nghiên cứu của đề tài, có thể nhận định: (1) viên MIX đạt tiêu chuẩn chất lượng thông qua kết quả kiểm nghiệm; (2) viên MIX an toàn thông qua đánh giá về độc tính cấp và độc tính bán trường diễn; (3) hiệu quả điều hòa lipid máu của viên MIX khá cao thông qua khảo sát tác dụng điều hòa lipid máu; (4) viên MIX có tác động ức chế hoạt tính HMG-CoA reductase thông qua khảo sát tác động ức chế HMG-CoA reductase in vivo.