Đặc điểm dịch tễ học phân tử gen k13 và đáp ứng của plasmodium falciparum với dihydroartemisinin piperaquin phosphat tại một số vùng sốt rét lưu hành

TạiViệtNam

Artemisinin là một chất chiết suất từ cây Thanh hao hoa vàng (Qinghaosu)cấu trúc sequiterpen lacton chiết xuất từ lá của cây thanh hao hoa vàng, đƣợc sửdụng hơn 1000 năm trong y học cổ truyền Trung Quốc để điều trị sốt và có mặttrong ít nhất 52 bài thuốc cổ truyền Trung Quốc. CácnghiêncứuvềKSTSRkhángthuốcvàhiệulựcphácđồchốngkháng tại một số khu vực miền Trung-Tây Nguyên của lý Bá lộc và cộng sự (2006) chothấy hiệu lực thuốc artesunate đơn trị liệu và thuốc phối hợp ACTS vẫn còn caovà chƣa có biểu hiện thất bại điều trị, tuy nhiên có một số. Tại Việt Nam, từ những năm 1990 đã có nhiều TNLS các artemisinin vàdẫn chất artesunat, dihydroartemisinin và đầu năm 2000,t á c g i ả Đ o à n H ạ n h Nhân và cộng sự của Viện Sốt rét - KST - CT Trung ƣơng và Quy Nhơn thửnghiệm đầu tiên với thuốc ACTs nhƣ CV-8 và sau đó là DHA-PPQ [26], [27],artemisinin-piperaquin, ASAQ, ASMQ bước đầu cho hiệu lực rất cao, nhiều thửnghiệm cho hiệu lực lên đến 100%.

Với hiệu lực phác đồ DHA-PPQ trong nghiên cứu này trình bày ở trên chothấy với phác đồ mới DHA-PPQ theo hướng dẫn mới của Bộ Y tế (2016) vớitổng liều 9 viên hoặc 12 viên tùy theo cân nặng của bệnh nhân nhƣ hiện nay, cóthể hiệu lực cao hơn so với nhóm bệnh nhân trênin vivovới thuốc DHA- PPQliệu trình tổng liều 8 viên của hướng dẫn chẩn đoán và điều trị của Bộ Y tế(2013) vì nghiên cứu năm 2014 đó có tỷ lệ ACPR là 100% và tỷ lệ tồn tại thể vôtính ngày D3là 11,5% nhƣng nghiên cứu 2016 lại không thấy tồn tại D3. Tuy nhiên, ở các điểm Ninh Thuận cũng cho thấy có tỷ lệ độtbiến gen đa hình K13 propeller với tỷ lệ dao động 20%, trên nhóm bệnh nhânngười Răglay, đặc biệt có đột biến C580Y mà loại này khá phổ biến ở khu vựctiểu vùng sông Mê Kông (Nguyễn Thanh Thùy Nhiên và cs., 2017)[ 29], [75].Tất cả dẫn liệu dựa trên bằng chứng, đặc biệt là đột biến gen K13 và thay đổi tỷlệ dao động K13 đóng vai trò nhƣ chỉ điểm cảnh báo kháng thuốc phù hợp vớiđịnh nghĩa của TCYTTG (WHO, 2017),.  Có dấu hiệu nguy hiểm hay sốt rét nặng có sự hiện diện KSTSR trong máuvào bất cứ ngày nào từ D4 đến D28 (D42) trên các bệnh nhân không hội đủ bấtkỳtiêuchuẩnnào củathấtbạiđiềutrịsớm(ETF);.  Có mặt KST vào bất cứ ngày nào từ ngày D4 đến D28/D42) với thân nhiệt≥37,5ºCtrên cácbệnhnhânkhônghộiđủtiêuchuẩnETFtrướcđó.

Jensen (1976) Bộ micro test KIT của WHO có các nồng độthuốc đƣợc gắn trên các giếng của phiến nhựa 96 giếng, chia làm 12 hàng, mỗihàng 8 giếng có 1 giếng chứng và 7 giếng có nồng độ thuốc khác nhau tùy thuộcmỗiloạithuốcthửnghiệm.Quytrìnhnàyđểxácđịnhsựnhạycảminvitrocủ a. - Để lam khô tự nhiên, sau 24-48 giờ nhuộm lam với dung dịch giêm sa vàdung dịch đệm với độ pH 6,8.Đọc kết quả dựa trên đếm số phân liệt 3 n h â n trở lên trong tổng số 200 KSTSR (gồm tất cả thể) ở mỗi giếng và so sánh vớigiếngchứng(A).Cácmẫuđủtiêuchuẩnđểđánhgiákhisốphânliệtđếmđƣợcởgiếng chứngphải10%(20 thểphân liệttrong200 KSTSR).

Kỹ thuậtsinhhọcphântử

GiảitrìnhtựADNxácđịnhđộtbiếngenK13liênquank h á n g artemisinin -Tách ADN bằng bộ kít QIAamp Blood DNA Mini Kit theo hướng dẫn củanhàsảnxuất. -Phản ứng PCR nhân bản gen K13 với trình tự mồi đƣợc thiết kế bởi Arieyvàcs2014vàgiảitrình tựgen K13theophươngphápSanger[40]. Một số yếu tố thuận lợi cho ký sinh trùng sốt rét phát triển và.

Đốitƣợng,thờigianđịađiểmnghiêncứu 1. Đốitượngnghiêncứu

 Nếu vì một lý do nào đó, bệnh nhân rút khỏi nghiên cứu hoặc vi phạm đềcương trước khi kết thúc nghiên cứu, thì nghiên cứu viên chính cần phải chođủliệutrình thuốcsốtréttheohướngdẫncủaBộYtếmớinhất. Chất lƣợng của phiến nhựa có thuốc đƣợc đảm bảo bằng độ nhạy cảm củachủng KST nhạy và kháng với Chloroquine đƣợc nuôi cấy liên tục trongphòng thínghiệmcủaNIMPE. Dùng pipet eppendorf, nhỏ 50l hỗn dịch máu môi trường vào mỗi giếngthử, bắt đầu từ giếng A và đi theo trình tự, cuối cùng là giếng H (có thể dùngmộtđầu típ).Luôn lắctubeđểđảmbảodịch treonhƣnhau;.

Đậy nắp phiến nhựa, ghi số hiệu bệnh nhân, thời gian bắt đầu nuôi trên nắptheođúng cộttương ứng,lắcnhẹphiếnnhựa;. Lấy bình nến ra ngoài tủ ấm, đặt phiến nhựa vào bình nến, đặt một đĩa nhựacó miếng bông thấm nước cất vào bình (làm giảm sự bay hơi của môitrường),đốtnến,đậynắpbìnhnến,khinếngầntắt,đóngkhoá;. Thờigianthuhoạch:DựavàoquansáthìnhthểKSTSRlúcđƣavàonuôicấy,KST thể tƣ dƣỡng trẻ: ủ ấm từ 33-35 giờ, KST thể tƣ dƣỡng ở tuổi trungbìnhthìủấmtừ28- 32giờ,KSTthểtƣdƣỡnggiàthìủấm23-25giờ;.

Thăm dò trước khi thu hoạch (nuôi thêm 3 giếng trên một phiến nhựa vôtrùng khôngcóthuốc). Xét nghiệm viên nên thăm dò nồng độ giêm sa và thời gian nhuộm thích hợpđểđánhgiácácthểvàsố lƣợng cho chính xác;. Đếm KSTSR: Một mẫu thử đƣợc đánh giá là thành công khi số lƣợng thểphân liệt ở giếng chứng phải bằng hoặc lớn hơn 10% trong tổng số 200 KSTthểvôtính.

 Đếm số lƣợng phân liệt có từ 3 nhân trở lên trong tổng số 200 KST thể vôtính(baogồmcảthểphânliệtvàthể tƣdƣỡng). -Tỷ lệ phần trăm thể phân liệt bị ức chế ở mỗi thuốc và mỗi nồng độ thuốcsovớitỷlệ phầntrămthểphânliệttạigiếngchứng. - Xác định nồng độ thuốc ức chế 50% (Inhibitor Concentration hay IC50), sựpháttriểncủaKSTSRvớicácthuốcsốtrétdihydroartemisinin,piperaquinphosphat, artesunat,chloroquinphosphat.

- Xác định nồng độ ức chế 50%(IC50), sự phát triển của KSTsẽ đƣợc tính toánbằng cách sử dụng phần mềm phân tích và phương pháp báo cáo (IVART)đƣợcphát triển trựctuyến bởi WWARN. - Trong quá trình phân tích số liệu và viết báo cáo: Giám sát chặt chẽ việc thuthập số liệu tại thực địa, làm sạch số liệu trên các bảng câu hỏi đã hoàn thành,mãhóavàloạibỏcácsố liệukhôngtincậy. Điều trị sốt rét theo phác đồ của BYT Bệnh nhân không đủ tiêu chuẩn đƣa vào NC in vivo và in vitro Bệnh nhân không đủ tiêu chuẩn đƣa vào nghiên cứu đột biến gen K13 Sàng lọc bệnh nhân sốt rét.