Nghiên cứu tính đa dạng hệ vi khuẩn đường tiêu hóa liên quan đến ung thư đại trực tràng
MỤC LỤC
DỊCH TỄ HỌC UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 1. Trên thế giới
Tỷ lệ mắc và tử vong do UTĐTT khác nhau đáng kể giữa các quốc gia và giữa các khu vực trên thế giới do liên quan tình trạng kinh tế xã hội của mỗi nước[1]. Theo GLOBOCAN 2020, Việt Nam có 16426 người mới được chẩn đoán UTĐTT, chiếm khoảng 9% trong các loại ung thư, đứng hàng thứ năm lần lượt sau ung thư gan, ung thư phổi, ung thư vú và ung thư dạ dày.
CƠ CHẾ BỆNH SINH UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 1. Khái niệm
Tình trạng viêm và các chất trung gian gây viêm được tiết ra bởi cả tế bào khối u và tế bào mô đệm, thúc đẩy các tế bào xâm nhập như đại thực bào liên quan khối u (tumor-associated macrophages - TAMs), tế bào ức chế có nguồn gốc tủy (myeloid-derived suppressor cells - MDSCs), tế bào mast, nguyên bào sợi liên quan đến ung thư (cancer-associated fibroblasts - CAFs), bạch cầu đơn nhân, bạch cầu đa nhân trung tính, tế bào lympho TCD8 và TCD4, tế bào đuôi gai (dendritic cells - DCs), tế bào giết tự nhiên (natural killer - NK), tế bào nội mô (endothelial cells), tế bào tiền thân nội mô (endothelial progenitor cells - EPCs), tiểu cầu và tế bào gốc trung mô ( mesenchymal stem cells - MSCs). Thành mạch máu khối u là một lớp không đồng đều, có nhiều lỗ mở, được mở rộng từ các vị trí kết nối của tế bào nội mô và gián đoạn hoặc mất màng đáy, điều này cũng góp phần làm tăng tính thấm của các mạch máu này, cùng với sự mất chức năng của hệ thống bạch mạch, gây ra tăng áp lực thẩm thấu trong khối u[31].
VAI TRề CỦA HỆ VI KHUẨN ĐƯỜNG TIấU HOÁ TRONG CƠ CHẾ BỆNH SINH UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG
Các yếu tố môi trường như tiếp xúc khói bụi, ô nhiễm, các chất hóa học và một số thói quen ăn uống: uống nhiều rượu, ăn nhiều chất béo và thịt đỏ, ăn ít chất xơ, cùng với những bệnh rối loạn chuyển hóa như tiểu đường, béo phì dẫn đến rối loạn hệ vi sinh vật đường ruột (dysbiosis). Loạn khuẩn đường ruột dẫn đột biến gen của các gen ức chế khối u, tiền gen sinh ung thư (proto- oncogenes) và các gen sửa chữa DNA đã thúc đẩy quá trình chuyển dạng của các tế bào biểu mô đại tràng bình thường, đồng thời làm thay đổi đáp ứng miễn dịch dẫn đến tiến triển UTĐTT.
CÁC YẾU TỐ NGUY CƠ GÂY UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 1. Tiền sử cá nhân
Tiền sử gia đình
Bệnh đa polyp tuyến gia đình (FAP) và hội chứng Lynch, còn được gọi là UTĐTT không đa polyp di truyền (HNPCC), là hai dạng UTĐTT di truyền phổ biến nhất. Hội chứng Lynch là do đột biến dòng mầm ở một trong các gen sửa chữa bắt cặp sai DNA (MMR), bao gồm MLH1, MSH2, MSH6 hoặc PMS2 hoặc phân tử kết dính tế bào biểu mô (EpCAM).
Lối sống và chế độ ăn
Tiêu thụ các thức ăn nhiều chất xơ như rau củ, trái cây, ngũ cốc nguyên hạt và ngũ cốc có liên quan đến tỷ lệ mắc UTĐTT thấp.
CHẨN ĐOÁN POLYP VÀ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 1. Chẩn đoán polyp đại trực tràng
Chẩn đoán ung thư đại trực tràng
Chụp hình khối u theo nguyên tắc chuyển hóa (PET, PET/CT, PET/MRI) với F18-FDG phát hiện u nguyên phát, di căn hạch, di căn xa, giúp đánh giá chính xác giai đoạn bệnh, mô phỏng lập kế hoạch xạ trị (với ung thư trực tràng). Mô bệnh học giúp chúng ta xác định loại và độ biệt hóa tế bào, khoảng cách khối u đến diện cắt phẫu thuật, sự lan rộng của khối u vào thành ruột và các cơ quan lân cận (giai đoạn T), có hoặc không có xâm lấn mạch bạch huyết và/hoặc quanh dây thần kinh, vị trí và số lượng hạch bạch huyết khu vực được phẫu thuật và số lượng hạch có tế bào ung thư xâm nhập (giai đoạn N); và cuối cùng, có thể xác định tình trạng di căn đến các cơ quan khác (gan, phúc mạc…) nếu được phẫu thuật cắt bỏ đồng thời hoặc sinh thiết[23, 110, 111].
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT 16S rRNA METAGENOMICS TRONG NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG HỆ VI KHUẨN ĐƯỜNG TIÊU HOÁ
Ứng dụng 16S rRNA metagenomics nghiên cứu mối liên quan giữa hệ vi khuẩn đường tiêu hoá với ung thư đại trực tràng trên thế giới
Khi phân tích tin sinh để tìm ra các chủng vi khuẩn là đặc trưng cho từng nhóm mẫu mô, nghiên cứu cho thấy các chủng vi khuẩn là đặc trưng cho mỗi loại mẫu mô gồm: Bacteroides, parabacteroides distasonis, Enterobacteriaceae, Pseudomonas veronii, Faecalibacterium prausnizii và Fusobacterium. Saffarian và cộng sự (2019) sử dụng kỹ thuật 16S rRNA metagenomics mô tả đặc điểm hệ vi khuẩn tại mẫu mô từ 58 bệnh nhân UTĐTT và 9 người khoẻ mạnh tình nguyện, kết quả cho thấy ở mẫu mô đại tràng phải hiện diện chủ yếu là Fusobacterium và B.
ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 1. Địa điểm
Thu thập dữ liệu lâm sàng và các mẫu mô đại trực tràng từ các BN được chẩn đoán xác định polyp và UTĐTT các giai đoạn vào điều trị trong khoảng thời gian từ tháng 03 năm 2015 đến tháng 12 năm 2020.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Thiết kế nghiên cứu
Phương tiện, sinh phẩm và quy trình kỹ thuật 1. Khám lâm sàng
* Quy trình phân tích dữ liệu gồm các bước: Tinh sạch read chất lượng thấp từ các tập tin fatq bằng công cụ Trimomatic, sau đó loại bỏ trình tự primer, nối 2 read overlap, loại bỏ nhiễu và các trình tự chimera bằng các công cụ chuyên dụng, từ đó sẽ phân tích phân loại taxonomy các trình tự để đánh giá thành phần các chỉ số đa dạng Alpha và Beta, cũng như tìm ra các Biomarker đặc trưng cho từng mẫu nghiên cứu. * Phương tiện: Hệ thống máy đọc tín hiệu huỳnh quang AriaMx Real-Time PCR; Máy đo quang (NanoPhotometer® P 300, Implen, Germany). Hoá chất LightCycler® 480 Probes Master Mix – Roche và các phương tiện kỹ thuật thường quy tại labo trung tâm thuộc Trung tâm Nghiên cứu Y học Việt Đức - Bệnh viện TWQĐ 108. * Quy trình lấy và lưu trữ mẫu bệnh phẩm mô UTĐTT: các mẫu mô được lấy tại thời điểm soi đại tràng trước phẫu thuật hoặc được lấy sau khi phẫu thuật. Riêng với các bệnh nhân UTĐTT giai đoạn I-III, các mẫu mô UTĐTT được lấy tại 2 vị trí gồm 1 mẫu mô tại vị trí u và 1 mẫu mô tại vị trí mô lành cạnh khối. Các mẫu mô này sẽ được lưu trữ trong tủ âm 80oC cho đến khi thực hiện xét nghiệm. * Kỹ thuật tách DNA từ mẫu mô UTĐTT: Khi thực hiện tách chiết, mẫu mô được dã đông trên đá, cắt 1 mẩu nhỏ bằng hạt đậu để tách chiết, mỗi mẫu dùng một dao riêng biệt. DNA được tách chiết từ mẫu mô tươi theo phương pháp NaOH/SDS[136]. Quy trình tách chiết được thực hiện theo các bước sau:. − Ly tâm nhanh để tập trung hỗn hợp xuống đáy ống. − Ly tâm nhanh để tập trung hỗn hợp xuống đáy ống. Phenol:Cloroform:isoamyl alcohol).
ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU
✓ Phân tích hồi quy logistic để xác định mối liên quan giữa các đặc điểm về tuổi, giới, nhiễm F. fragilis, vị trí u với nguy cơ ung thư:. Đầu tiên phân tích hồi quy logistic đơn biến tuổi, giới, nhiễm F. fragilis, vị trí u để tính OR thô của các mối liên quan. Sau đó phân tích hồi quy logistic đa biến để xác định các biến là yếu tố tương tác hay yếu tố nhiễu. ĐẶC ĐIỂM CHUNG. Đặc điểm tuổi và giới. Đặc điểm tuổi và giới của bệnh nhân. Đặc điểm tuổi, giới. thấp nhất, cao nhất). Đặc điểm mô bệnh học của bệnh nhân ung thư đại trực tràng Đặc điểm mô bệnh học Số lượng (n) Tỷ lệ (%).
TÍNH ĐA DẠNG HỆ VI KHUẨN TẠI MÔ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG, MÔ GAN VÀ HẠCH DI CĂN
Thành phần hệ vi khuẩn (taxonomic profilling)
Các chi chiếm tỷ lệ cao nhất ở cả ba loại mẫu mô đại trực tràng, gan, hạch gồm: Enhydrobacter, Acinetobacter, Janibacter, Aeribacillus, paracoccus, Thermus và Pseudomonas, Sphingomonas, Corynebacterium, Cutibac, Staphylococcus. Các loài chiếm tỷ lệ cao nhất ở cả ba loại mẫu mô đại trực tràng, gan, hạch gồm: Kocuria palustris, Burkholderia multivorans, Moraxella osloensis, Acinetobacter baumannii, Fusobacterium necrophorum, Pseudomonas stutzeri và Bacteroides fragilis.
Chỉ số đa dạng sinh học alpha (Alpha diversity) 1. Các chỉ số alpha ở các nhóm mẫu
Số lượng observer_features chưa bão hòa và chỉ số shannon đã bão hòa, cho thấy rằng sự khác biệt về trình tự 16S rRNA có thể được xác định thêm khi tăng dung lượng giải trình tự nhưng số lượng các loài vi sinh khác nhau vẫn được bảo toàn và gần như đã được xác định đầy đủ. Chỉ số đa dạng sinh học alpha (Observed species và Shannon index) tại nhóm mô đại trực tràng cao hơn tại nhóm mô gan di căn (p<0,05).
Chỉ số đa dạng sinh học beta (Beta diversity)
Sự khác biệt về chỉ số đa dạng sinh học beta giữa các nhóm mẫu đại trực tràng và gan di căn, đại trực tràng và hạch di căn dựa trên Bray–Curtis dissimilarity và Jaccard distance là có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Không có trường hợp nào có sự hiện diện của ngành Fusobacteria trong cả 3 loại mẫu mô UTĐTT, mô gan và hạch di căn ở 11 bệnh nhân UTĐTT di căn gan và hạch.
Kết quả model 1 được hiệu chỉnh thêm yếu tố vị trí u
BÀN LUẬN
Đặc điểm về tuổi và giới
Các nghiên cứu cho thấy có sự khác biệt đặc điểm về giới giữa các khu vực địa lý khác nhau, tuy nhiên hầu hết các nghiên cứu có tỷ lệ mắc UTĐTT ở nam giới cao hơn nữ giới. Điều này có thể được giải thích là do liên quan đến lối sống, chế độ ăn uống và sinh hoạt của nam và nữ là khác nhau.
Đặc điểm vị trí ung thư đại trực tràng
Như vậy, qua tổng hợp các nghiên cứu ở nhiều nước trên thế giới nhận thấy UTĐTT có thể gặp ở nhiều vị trí khác nhau. Tuy nhiên, ung thư ở đại tràng hay gặp hơn so với trực tràng, ung thư đại tràng trái phổ biến hơn đại tràng phải trên nhóm BN UTĐTT ở các nước Châu Á.
Đặc điểm mô bệnh học của bệnh nhân ung thư đại trực tràng
Trên nhóm BN UTĐTT tại Mỹ, ung thư đại tràng phải hay gặp hơn ung thư đại tràng trái và trực tràng. Có sự khác biệt này có thể là do liên quan đến chế độ ăn, lối sống và chủng tộc khác nhau giữa các nước.
Đặc điểm nồng độ CEA huyết tương tại thời điểm chẩn đoán
Như vậy, nồng độ CEA rất khác nhau giữa các nghiên cứu và giữa các giai đoạn UTĐTT, điều này có thể là do tăng nồng độ CEA không đặc hiệu trong UTĐTT, nồng độ CEA có thể tăng trong các bệnh ung thư ngoài đường tiêu hoá[118].
TÍNH ĐA DẠNG HỆ VI KHUẨN TẠI MÔ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG, MÔ GAN VÀ HẠCH DI CĂN
Chen và cộng sự (2012), nghiên cứu trên 27 mẫu mô UTĐTT và 27 mẫu mô lành cạnh ung thư, ở mức ngành có sự tương đồng về độ phong phú tương đối tại mô ung thư và mô lành cạnh ung thư, gồm các ngành chính là Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, Fusobacteria và Actinobacteria[150]. Chỉ số đa dạng sinh học Shannon và số lượng observed OTUs cao nhất ở nhóm mô ung thư, tiếp theo là nhóm mô lành cạnh ung thư và thấp nhất là nhóm u tuyến, cho thấy độ đa dạng vi sinh ở nhóm mô ung thư là cao nhất, thấp nhất là nhóm mô u tuyến, tuy nhiên sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05)[71].
MỐI LIÊN QUAN GIỮA F. NUCLEATUM VỚI UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng cho kết quả tương tự như các nghiên cứu trước đây, có thể là do phần lớn các bệnh nhân tham gia nghiên cứu của chúng tôi và các nghiên cứu trước đây được chẩn đoán UTĐTT giai đoạn II và III. Flangan và cộng sự (2014) nghiên cứu trên 49 bệnh nhân UTĐTT người Cộng hoà Séc, 45 bệnh nhân UTĐTT người Đức và 28 bệnh nhân UTĐTT, 52 bệnh nhân u tuyến người Ireland.
MỐI LIÊN QUAN GIỮA B. FRAGILIS VỚI UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG
Độc tố fragilysin đã được chứng minh là làm thay đổi nhanh chóng cấu trúc và chức năng của các tế bào biểu mô đại tràng, bao gồm cả sự phân cắt protein ức chế khối u và E-cadherin. Sự phân cắt E-cadherin bởi độc tố fragilysin làm tăng nồng độ β-catenin trong tế bào chất, cho phép nó chuyển vị trí vào nhân làm tăng sinh tế bào biểu mô cũng như tăng biểu hiện của gen gây ung thư[20].