Phương pháp sản xuất giá ái lực miễn dịch bắt aflatoxin B1

Phương pháp phân tích hóa lí

Các phương pháp này dùng phát hiện và định lượng aflatoxin nhanh, chính xác và có tính chuyên biệt cao hơn so với phương pháp sinh học; hiện nay được dùng chủ yếu trong các phòng thí nghiệm. Thông thường, tuỳ theo loại thực phẩm và khối lượng thực phẩm cần phân tích, việc lấy mẫu được thực hiện từ nhiều vị trí khác nhau với những lượng khác nhau. Các mẫu này được tiến hành đồng nhất và từ mẫu đồng nhất này, một lượng thích hợp sẽ được trích ra để tiến hành phân tích aflatoxin, thường từ 20-100g tuỳ thuộc vào loại thực phẩm và hàm lượng aflatoxin cao hay thấp trong mẫu.

Đối với mẫu có thành phần béo từ 5% trở lên, sử dụng các dung môi: hexane, petrolium ether, ethyl dioxide, pentane hoặc isooctane nhằm tách chất béo trước khi tiến hành chiết aflatoxin. Chiết aflatoxin: do aflatoxin tan được trong các dung môi hơi phân cực và không tan trong những dung môi phân cực cao, nên chúng thường được chiết với các dung môi hữu cơ như dichloromethane, benzene, acetonitril, acetone, chloroform, hay methanol. Trong khi độ hoà tan của aflatoxin trong nước thấp, dung môi có nước có thể thấm vào các mô ưa nước làm cho sự chiết tách hữu hiệu hơn.

Quá trình này có thể thực hiện ở nhiệt độ phòng bằng cách lắc thông thường trong 30 phút hoặc dùng máy xay tốc độ cao trong 1-3 phút. Mục đích: Loại bỏ các hợp chất khác có thể hiện diện cùng aflatoxin trong dịch chiết mẫu để tránh ảnh hưởng đến việc xác định aflatoxin cũng như việc tạp chất sẽ làm bẩn cột, mất thời gian rửa cột và làm giảm tuổi thọ của cột.  Phương pháp chiết pha lỏng-lỏng: thực hiện trong phễu chiết bằng cách chuyển aflatoxin từ dung môi chiết (acetone hay methanol) vào dung môi khác (ví dụ như chloroform).

 Loại tạp bằng sắc kí hấp phụ: Kĩ thuật này hiện nay đã được phát triển và dùng rất nhiều do ưu điểm dễ sử dụng và hiệu quả loại tạp rất tốt trên nhiều loại mẫu khác nhau. Ví dụ, cột chiết xuất pha rắn SPE (solid-phase extraction) được chế tạo sẵn chứa các chất nhồi LC-CN có khả năng bắt tốt các aflatoxin ở hàm lượng thấp. Tuy vậy, với những giá rắn từ các chất không phân cực như: C18, C8, C2, cyclohexyl, phenyl, florisil…liên kết với aflatoxin hoặc với các tạp chất theo cơ chế kỵ nước không có tính chọn lọc, phân giải kém trong nhiều trường hợp, và không lý tưởng khi aflatoxin chiếm tỉ lệ nhỏ so với tạp chất [14].

Chất chiết sau khi được làm sạch thường được cô đặc bằng cách cho bốc hơi trong máy cô quay (Rotary Evaporator) dưới áp suất thấp hoặc dùng nồi chưng cách thủy dưới luồng khí nitơ nhẹ. Các phương pháp sắc kí thường được sử dụng, dựa trên nguyên tắc phân tách giữa 2 pha: pha tĩnh và pha động (lỏng hoặc khí) khi cho chất cần tách qua lớp sắc kí. Pha tĩnh có tính liên kết với aflatoxin làm chậm sự di chuyển của các chất (do các đặc điểm lí hóa khác nhau) nên tạo ra sự phân biệt giữa chúng.

Vật liệu

Ống nghiệm Pipetman Eppendorf Bình Erlen Giấy lọc thường Lọc thuỷ tinh 3.2.3 Thiết bị sử dụng. Máy đo huỳnh quang (Vicam – Series – 4 Fluorometer, USA) được thiết kế đặc biệt cho việc sử dụng cột IAC. Máy lắc (Vortex), cân điện tử, tủ lạnh, thiết bị làm khô dưới luồng N2 nhẹ.

Phương pháp nghiên cứu

• Các phương pháp phục vụ cho nghiên cứu .1 Quy trình tạo giá ái lực miễn dịch
• Khảo sát các chỉ tiêu .1 Độ nhạy của cột

 Dung môi phải được giữ trong những thiết bị không thấm nước, đục, tránh ánh sáng và để trong tủ lạnh.  Để tránh thất thoát aflatoxin do bị hấp thu, tất cả thiết bị thủy tinh dùng trong thao tác phải được ngâm trong dung dịch acid loãng (HCl-1N) vài giờ, sau đó rửa và làm khô. Photon ánh sáng ở vùng tử ngoại do đèn nguồn phát khi qua bộ tạo ánh sáng đơn sắc sẽ chỉ cho qua ánh sáng với bước sóng nhất định, và khi qua dung dịch trong cốc sẽ gây ra sự thay đổi năng lượng của các điện tử.

Khi phân tử hấp thụ năng lượng ánh sáng này, các điện tử sẽ chuyển lên mức năng lượng cao hơn. Tuy nhiên, chỉ có điện tử ở các hợp chất có nối đôi hay/và ba mới hấp thụ ánh sáng ở vùng tử ngoại. Cực đại hấp thụ (λmax) là bước sóng mà ở đó chất cho độ hấp thụ lớn nhất.

OD360: giá trị hấp thụ ở cực đại hấp thụ (λmax) M: trọng lượng phân tử chất cần phân tích. Mục đích: Pha loãng dung dịch AFG1 chuẩn, cần thiết cho những lượng mẫu rất ít sẽ dùng ở các thí nghiệm sau. Cách thực hiện: Cho 2 cóng chứa đầy dung môi CHCl3 vào quang phổ kế, sau đó lấy cóng bên ngoài ra, thay dung môi bằng dung dịch AFG1 đã pha vào đầy cóng, cho cóng vào lại quang phổ kế.

Các phân tử hấp thụ các photon ánh sáng thích hợp để chuyển từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích. Ngược lại, các phân tử đã ở trạng thái kích thích có thể trở về trạng thái cơ bản bằng cách giải phóng.  Cực đại kích thích (λEx.) là bước sóng mà khi bị kích thích tại bước sóng này, chất cho cường độ phát quang tương đối (Itđ) là lớn nhất.

Sau đó, cho tuần tự 3 ống chuẩn của máy (màu đỏ, xanh, vàng) vào để chuẩn máy. Mục đích: Khảo sát sự tương quan tuyến tính giữa lượng AFG1 và cường độ sáng trên máy huỳnh quang. Đo trên huỳnh quang kế với các nồng độ AFG1 trên (thể tích đo là 2 ml).

Hàm lượng AFG1 tối thiểu sau khi qua cột IAC được xác định bằng phương pháp huỳnh quang kế. Mục đích : khảo sát độ đồng đều của các cột IAC (khả năng bắt giữ của các cột có như nhau không).