Các phương pháp định lượng Azithromycin trong huyết tương bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao

Một số phơng pháp định lợng AZI trong dịch sinh học

Theo tài liệu khoa học của nớc ngoài có thể định lợng AZI trong dịch sinh học bằng những phơng pháp sau:. *Các nghiên cứu sử dụng sắc ký. Một số nghiên cứu định lợng AZI trong dịch sinh học bằng HPLC. T/ liệu Mẫu thử Cột sắc ký Điều kiện sắc ký. - Dung môi chiết: Diethyl ether. [10] thanh ngờiHuyết. - Dung môi chiết: Hexan. - ChÊt dÉn xuÊt huúnh quang: FMOC-Cl. [14] Huyết Chromegabond -Pha động: MeCN-MeOH-NH4COOCH3-. 5àm) Norwark USA. Định lợng trong môi trờng thạch với chủng vi khuẩn chỉ thị là Micrococcus luteus NCTC 8440, khoảng nồng độ tuyến tính từ 0,005 đến 1mg/L[11].

Nguyên tắc chung về phơng pháp phân tích bằng HPLC [2]

Vì vậy, sau khi đã chọn đợc các điều kiện tối u cho quá trình sắc ký, tiến hành ghi sắc đồ của mẫu phân tích, và xác định thời gian lu của từng pic ứng với mỗi chất trong sắc đồ. - Phơng pháp nội chuẩn: Để giảm sai số và tăng độ lặp lại, ngời ta th- ờng dùng một chuẩn thứ 2 thêm vào mẫu phân tích và mẫu chuẩn đối chiếu. Trong cùng điều kiện sắc ký nó có thời gian lu gần với thời gian lu của chất phân tích nhng đợc tách hoàn toàn, có tính chất tơng tự nh chất cần phân tích nhng không gây ảnh hởng lên tín hiệu của chất cần phân tích.

Vài nét về HPLC với detector huỳnh quang

Để tăng độ tin cậy ngời ta dùng hệ số đáp ứng của detector đối với từng thành phần của mẫu. Nếu chất cần phân tích đợc phản ứng với thuốc thử trớc khi qua cột thì kỹ thuật này gọi là tạo dẫn xuất trớc cột. Nếu chất cần phân tích đợc phản ứng với thuốc thử sau khi đã đi ra khỏi cột, thì đợc gọi là tạo dẫn xuất sau cột.

V i nét về LC-MS. à

Kỹ thuật này đợc mô tả nh sau: Các phân tử dung môi và hóa chất sau khi ra khỏi cột sắc ký sẽ đợc đa vào một ống mao quản cao thế 2 đến 5 KV (điện thế dơng ở đầu kim tạo ion dơng, điện thế âm ở đầu kim tạo ion âm và đợc quyết định tùy chất khảo sát). -Bộ xử lý dữ liệu: Tín hiệu điện đợc khuyếch đại trớc khi chuyển thành tín hiệu phục vụ sử lý dữ liệu theo yêu cầu khác nhau: Ghi phổ, định lợng. Kỹ thuật này chọn một ion ở chế độ MS lần 1, ion đó sẽ đợc phân tích tiếp bằng cách tạo ra mảnh ion nhỏ hơn đặc trng cho ion trớc đó, đợc phân tích MS lần 2.

Đối tợng, nội dung và phơng pháp nghiên cứu

• Phơng pháp nghiên cứu

Định lợng AZI trong HT là quá trình phân tích phức tạp yêu cầu phơng pháp phân tích phải có tính chọn lọc tốt, độ nhạy, độ chính xác cao. Sau khi tìm hiểu sâu về đối tợng nghiên cứu, mục tiêu của đề tài và tham khảo tài liệu chúng tôi đã lựa chọn hai phơng án để tiến hành khảo sát đó là: HPLC với detector huỳnh quang và LC-MS. - Khảo sát nhiệt độ phản ứng tạo dẫn xuất: Giữ nguyên các điều kiện phản ứng khác, chỉ thay đổi nhiệt độ từ 30 đến 70oC, cách 10oC.

- Khảo sát thời gian phản ứng: Giữ nguyên nhiệt độ phản ứng tối u là 50oC, thay đổi thời gian phản ứng trong khoảng từ 30 đến 60 phút, cách 10 phót. Sau khi tìm hiểu, tham khảo một số tài liệu chúng tôi chọn hai chất có cùng cấu trúc phân tử là CLA và ROXI để tiến hành khảo sát chọn làm chuẩn nội. Từ các tính chất lý hóa của AZI và theo các tài liệu đã công bố, chúng tôi chọn xây dựng quy trình sử lý mẫu theo phơng pháp chiết lỏng - lỏng.

- Pha động: dựa vào các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát trên hệ pha động acetonitril : amoni acetat 0,05M với tỷ lệ khác nhau và chạy chế độ. LOD là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có thể xác định đợc nhng không nhất thiết phải định lợng đợc trong điều kiện thí nghiệm cụ thể. Chuẩn bị các mẫu AZI trong HT trắng ở 3 nồng độ, mỗi nồng độ làm 5 mẫu và xử lý nh trong phần xác định độ đúng, sau khi tiến hành sác ký, đánh giá độ lệch chuẩn tơng đối của các mẫu theo từng nồng độ.

Tiến hành lấy máu định lợng AZI trong HT 2 ngời tình nguyện sử dụng chế phẩm có chứa AZI ( uống 2 viên nén Athromax hàm lợng 250 mg).

Kết quả

• Khảo sát quy trình định lợng AZI trong dung môi bằng HPLC detector huúnh quang
• Khảo sát xây dựng chơng trình LC-MS để định lợng AZI trong HT

Định lợng AZI trong nền mẫu HT bằng phơng pháp HPLC với detector huỳnh quang đòi hỏi trải qua quá trình xử lý mẫu phức tạp và quá trình dẫn xuất hóa để tạo chất phát huỳnh quang. Kết quả khảo sát thời gian phản ứng tạo dẫn xuất huỳnh quang Kết quả cho thấy phản ứng xảy ra tốt nhất trong vòng khoảng 40 phút, do đó chúng tôi quyết định chọn thời gian phản ứng là 40 phút và phản ứng ở 50 0C. Nhận xét: trên sắc ký đồ mẫu trắng tại các vị trí tơng ứng với thời gian lu của các pic AZI và CLA đã dẫn xuất hóa không xuất hiện pic lạ, các pic AZI và CLA cân đối, sắc nét, tách riêng biệt.

Đờng chuẩn hồi quy có dạng thẳng và hệ số tơng quan lớn hơn 0,999 chứng tỏ có sự tơng quan tuyến tính chặt giữa tỷ số diện tích pic (AZI/CLA) và nồng độ AZI ở trong khoảng nồng. Để xác định điều kiện khối phổ, trớc tiên chúng tôi pha từng chất trong pha động, sau đó bơm trực tiếp bằng syringe và chạy chơng trình Tune để điều chỉnh các thông số khối phổ. - Bật máy khối phổ, khởi động phần mềm điều khiển trên màn hình windows (Instrument Setup) vào Tune Plus, xuất hiện cửa sổ Tune Plus, chọn chế độ +ESI.

Nhấn vào biểu tợng Tune trên màn hình sẽ xuất hiện cửa sổ chạy chế độ Automatic Tune, trong ô Mass (m/z) đánh số 749 để Tune cho mảnh mẹ, máy sẽ tự động điều chỉnh và tối u hóa các thông số sao cho bắt ion m/z= 749 tốt và nhạy nhất. Pha dung dịch chuẩn AZI 1àg/ml và dung dịch chuẩn ROXI 10àg/ml trong pha động, chạy LC-MS chế độ SIM, pha động acetonitril : amoni acetat 0,05M(5:5). Kết quả khảo sát cho thấy với tỷ lệ (6:4) có khả năng tách tốt nhất, cho 2 pic sắc nét tách rời nhau, chân pic gọn, cân đối và có thời gian phân tích hợp lý.

Nhận xét: Trên sắc ký đồ mẫu trắng tại các vị trí tơng ứng với thời gian lu của AZI và ROXI không xuất hiện pic lạ, các pic AZI và ROXI cân đối, sắc nét, tách riêng biệt. Nhận xét: độ lệch chuẩn tơng đối của các thông số phân tích đều nhỏ hơn 4%, điều này chứng tỏ hệ thống sắc ký có tính thích hợp chấp nhận đợc, có thể ứng dụng phân tích mẫu để cho kết quả tin cậy. Đờng chuẩn hồi quy có dạng thẳng và hệ số tơng quan lớn hơn 0,99 chứng tỏ có sự tơng quan tuyến tính chặt giữa tỷ số diện tích pic (AZI/ROXI) và nồng độ AZI trong HT ở khoảng nồng độ khảo sát.

Bàn luận

• Về xây dựng và thẩm định phơng pháp định lợng AZI

- Phơng pháp xử lý mẫu: để tạo điều kiện tối u cho định lợng AZI trong HT ngời (có nồng độ thấp, nền mẫu phức tạp) đạt kết quả tốt, quy trình xử lý mẫu phải có khả năng loại tạp tốt và hiệu suất chiết cao. Tuy nhiên, trong quá trình bay hơi dung môi, để tránh AZI có thể bị phân hủy bởi nhiệt độ, nên khi bay hơi dung môi không để nhiệt độ cao ( nhỏ hơn 50oC). Dựa vào các tài liệu đã công bố, kết hợp với các điều kiện khách quan phù hợp chúng tôi tiến hành khảo sát các điều kiện sắc ký.

Qua các kết quả thu đợc, chúng tôi nhận thấy chơng trình đợc xây dụng và đã sử dụng trong đề tài là phù hợp để phân tích định lợng AZI trong HT ng- ời. Sau khi xây dựng xong một quy trình phân tích, để đảm bảo có thể áp dụng quy trình vào phân tích trong thực tế một cách chính xác, cần thẩm định. Xây dụng phơng pháp bằng LC-MS đảm bảo tốt đợc tính chọn lọc và độ nhạy nhng hạn chế là thiết bị cha đợc trang bị rộng rãi tại các trung tâm kiểm nghiệm, hiện tại chỉ có tại các trung tâm kiểm nghiệm đầu ngành do đó triển khai ứng dụng các phơng pháp phân tích trên LC-MS trong ngành Y, Dợc còn rất hạn chế.

Giới hạn định lợng này là phù hợp để định lợng AZI trong huyết tơng phục vụ nghiên cứu sinh khả dụng và tơng đơng sinh học. Trong đề tài chúng tôi tiến hành thẩm định độ chính xác theo tiêu chí độ lặp lại trong ngày và kết quả cho thấy đối với độ lặp lại trong ngày, các giá trị RSD biến thiên từ 2,24% - 7,29% (< 10%), vậy phơng pháp phân tích đợc xây dựng trong đề tài đạt tiêu chuẩn về độ chính xác cho phơng pháp phân tích các dịch sinh học [19], và có độ chính xác trung bình. * Độ ổn định: Do điều kiện khách quan là không chủ động đợc thời gian cũng nh lịch trình sử dụng thiết bị (LC-MS) nên chúng tôi cha thực hiện.

Có thể dùng phơng pháp này để định lợng AZI trong HT ngời dùng thuốc phục vụ công tác điều trị, nghiên cứu sinh khả dụng và tơng đơng sinh học.