Nghiên cứu phân lập trình tự điều khiển biểu hiện gen ubiquitin từ bèo tấm trong ứng dụng công nghệ gen thực vật.

Phân bố của bèo tấm

Bèo tấm với tên khoa học Lemnaceae là loài sinh vật thủy sinh có khả năng tồn tại và phát triển ở nhiều nơi trên thế giới, trừ những vùng cực bắc và cực nam quanh năm giá lạnh. Hiện nay, các loài bèo này phân bố khá phổ biến trên các vùng mặt nước, ao hồ đồng ruộng và tập trung nhiều ở khu vực đồng bằng Bắc Bộ và Nam bộ [7], [36].

Đặc điểm hình thái bèo tấm

Hoa và quả bèo

Năm 2002, Les và cộng sự đã dựa trên đặc điểm về hình thái nhiễm sắc thể và vi phân tử (DNA của nhân và lục lạp) đề ra giả thiết về cây phân loại của bèo tấm gồm 5 chi tức là có thêm một chi mới là Landoltia [38]. Một số nghiên cứu gần đây của Rothwell và cộng sự, dựa trên sự so sánh trình tự đoạn intron tRNALeu UAA (trnL) và tRNAPhe UAA (trnF) của bộ gen lục lạp đã xác định rằng họ Lemnaceae và Pisita cùng thuộc họ ráy Araceae [48].

Hình thức sinh sản của bèo tấm

Hệ gen của bèo tấm

Kích thước gen nhân của các loài bèo tấm là khác nhau, nhỏ nhất ở Spirodela và lớn nhất ở Wolffia. Kích thước bộ gen của một số loài bèo tấm so với các loài đối chứng được liệt kê trên bảng 1.1 [36].

Giá trị dinh dƣỡng

Gen lục lạp (cpDNA) của bèo tấm là đối tượng được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất. Thành phần và hàm lƣợng các hợp chất hữu cơ có trong cánh bèo Thành phần Hàm lượng (% trọng lượng chất khô).

Tiềm năng sử dụng bèo tấm trong công nghệ sinh học

Trong các loài thực vật được nghiên cứu để làm hệ thống tái sinh, các loài thuộc họ bèo tấm đang được đặc biệt quan tâm với vòng đời ngắn và khả năng tăng sinh khối nhanh. Quy trình chuyển gen vào bèo tấm cũng tương tự như quy trình biến nạp gen ở một số loài thực vật khác, tức là phải tạo vật liệu vô trùng trong ống nghiệm, tạo callus, sau đó tái sinh callus đã chuyển gen thành cây hoàn chỉnh.

Promoter và ứng dụng trong công nghệ gen thực vật 1 Cấu trúc gen sinh vật

Phân loại promoter

Quá trình phiên mã (giai đoạn sơ khai đầu tiên để biểu hiện một gen thành protein), chịu sự điều khiển của nhiều yếu tố: promoter, các nhân tố phiên mã, các trình tự tăng cường, trình tự kết thúc…. Vùng điều chỉnh (regulatory region) là vùng điều điều khiển quá trình biểu hiện gen Ubi-1 ở cây ngô là đoạn trình tự bắt đầu từ vị trí -899 bp từ đầu 5’ của vị trí khởi đầu phiên mã đến vị trí 1093 bp đầu 3’. Cần nhấn mạnh rằng không có một promoter hoàn toàn đặc hiệu: các promoter hoạt động bình thường ở một số mô nhất định trong khi ở các mô khác thì không hoặc chỉ hoạt động yếu (sự biểu hiện yếu).

Trong số các promoter đặc hiệu, có nhóm promoter biểu hiện đặc hiệu mô (tissue specific promoter), biểu hiện đặc hiệu về thời gian, biểu hiện cảm ứng với môi trường (environmentally inducible promoter). Promoter này chứa các trình tự đặc trưng của một promoter như hộp TATA, hộp CCAAT… và các trình tự đặc hiệu quyết định sự biểu hiện gen đặc hiệu bó mạch như hôp ASL, hộp GATA…[66]. Promoter điều khiển biểu hiện gen rbcS (ribulose – 1,5 – bisphosphate carboxylase small subunit) cảm ứng ánh sáng ở nhóm cây hai lá mầm, chứa trên 30 vùng trình tự bảo thủ trong đó những vùng cảm ứng ánh sáng là hộp G, hộp I, GT – 1 (hộp II)… Hộp G có trình tự đặc trưng là CACGTG, hộp I có trình tự nhận biết là GATAAGR và trình tự ngược chiều của nó – YCTATC cũng được chú ý đặc biệt.

Tình hình nghiên cứu chuyển gen ở bèo tấm 1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Năm 2001, các nhà nghiên cứu thuộc đại học phía Bắc bang Carolina đã áp dụng thành công phương pháp chuyển gen vào bèo tấm thông qua Agrobacterium tumefaciens ở giai đoạn nốt sần trước khi tái sinh cánh L.gibba G3 và L.minor 8744 [63]. Có tới 12 loại protein đã được biểu hiện thành công trên hệ thống Lemna SystemTM, gồm các đoạn peptide nhỏ, mảnh Fab (Fabs), các kháng thể đơn dòng (mAbs) và các enzyme đa tiểu phần lớn… Lemna SystemTM là hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp dựa trên nền tảng các loài bèo tấm thuộc chi Lemna được hãng Biolex phát triển và đăng ký độc quyền tại nhiều nước trên thế giới [27]. Quy trình biến nạp vào bèo tấm cũng tương tự như quy trình biến nạp ở các loài thực vật khác, tức là phải tạo vật liệu vô trùng trong ống nghiệm, tạo đầu callus rồi sau đó tái sinh callus đã chuyển gen thành cây hoàn chỉnh.

Các nghiên cứu ban đầu chủ yếu nhằm mục đích sử dụng cho chăn nuôi và mới chỉ dừng lại ở những khảo sát cơ bản nhất về các đặc tính sinh lý, sinh hóa của một số loài bèo đặc hữu có mặt phổ biến ở Việt Nam. Tại đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh, các nhà khoa học đã thử nghiệm bổ sung bèo tấm làm thức ăn cho hơn 200 con gà giống Tàu Vàng, kết quả gà tăng trọng nhanh và chi phí thức ăn giảm 10 -15%/1 kg thịt. Hiện nay đã có nhiều loại promoter được phân lập và sử dụng, trong đó promoter ubiquitin là một đối tượng được quan tâm nghiên cứu do nó có khả năng làm tăng mạnh mẽ quá trình biểu hiện gen từ mức độ phiên mã cho tới dịch mã [41].

Phương pháp nghiên cứu

• Các phương pháp sử dụng để tách dòng gen [51]
• Nhân đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR và tách dòng trong vector pJET1.2 1. Nhân đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR

Nguyên tắc của kỹ thuật PCR là sử dụng DNA polymerase chịu nhiệt, ví dụ Taq DNA polymerase được tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus để tổng hợp trong ống nghiệm các đoạn DNA mới từ mạch khuôn trong môi trường có dư các dNTP và cặp mồi đặc hiệu. Như vậy, sau mỗi chu kỳ phản ứng từ 1 đoạn DNA cần nhân sẽ có 2 đoạn được tổng hợp, sau n chu kỳ sẽ có 2n bản sao đoạn DNA mong muốn, chiều dài thực tế của đoạn DNA được nhân bản bằng đúng khoảng cách giữa hai đầu xuất phát của hai đoạn mồi. Đây là phương pháp được thiết kế đặc biệt để tách dòng gen mong muốn (hoặc sản phẩm PCR nói chung) được nhân lên bằng enzyme Taq DNA polymerase và đạt hiệu quả gắn đoạn rất cao chỉ trong thời gian ngắn là 10 phút.

Dịch chiết này sau đó được xử lý tiếp bằng hỗn hợp chloroform : isoamyl alcohol (24 : 1) nhằm loại bỏ hoàn toàn phenol có lẫn trong dịch chiết và một lần nữa làm sạch DNA, bước này có thể lặp lại 1 - 2 lần. Vì agarose là một loại polyme tách từ rong biển, được cấu tạo bởi 2 monomer là D-galactose và 3,6-anhydro L-galactose, nên sau khi đun sôi với dung dịch đệm agarose sẽ đông lại tạo cấu trúc dạng mạng lưới với kích thước lỗ phụ thuộc vào nồng độ của agarose (kích thước lỗ là 150 nm ở nồng độ 1% và 500 nm ở nồng độ 0,16%). Kỹ thuật PCR được tiến hành trong môi trường đệm thích hợp với hoạt động xúc tác của enzyme về pH, lực ion,… Thành phần dung dịch đệm có thể thay đổi tùy theo loại enzyme sử dụng trong kỹ thuật PCR.

Một yếu tố quan trọng trong thành phần của đệm là ion Mg2+, khi tạo thành phức với dNTP, Mg2+ có tác dụng gắn dNTP với enzyme, kích hoạt DNA polymerase, tăng sự kết hợp giữa mồi và đoạn khuôn, cũng như tác động vào sự nóng chảy của DNA mạch kép. SDS cùng với EDTA trong dung dịch II có vai trò ức chế các nuclease do EDTA liên kết các ion Mg2+ (yếu tố cần thiết cho hoạt động của các nuclease), vì vậy ngăn không cho các nuclease phân giải DNA trong quá trình tách chiết.