Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase từ một số chủng nấm sợi thuộc giống Aspergillus, Trichoderma và ứng dụng
MỤC LỤC
Chitin (cơ chất của chitinase) 1. Lịch sử nghiên cứu chitin [55]
Chitin được mô tả lần đầu tiên bởi Braconnot vào năm 1811, khi nghiên cứu loài nấm Agaricus volvaceus và một vài loài nấm khác xử lý với dung dịch kiềm, ông thu được sản phẩm và đặt tên là chitin (chitin có nguồn gốc từ Hy Lạp là “tunnic” nghĩa là lớp vỏ bọc). Trong giới động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng trong lớp vỏ của một số động vật không xương sống như côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn. Chitin tồn tại trong tự nhiên ở dạng tinh thể, đó là cấu trúc gồm nhiều phân tử được nối với nhau bằng các liên kết hydro tạo thành một hệ thống sợi.
CaCO3, protein, lipid, các chất hữu cơ … nên việc tách chiết còn khó khăn vì phải đảm bảo cả hai yếu tố cùng một lúc là vừa loại hết tạp chất đồng thời không làm biến đổi tính chất của chitin. Qua nghiên cứu về sự thủy phân chitin bằng enzyme hay HCl đậm đặc thì người ta thấy rằng chitin là một polymer được tạo thành từ các đơn vị N-acetyl-β-D-Glucosamine liên kết với nhau bởi liên kết 1-4 glucoside. Các chuỗi α–chitin xếp xuôi, ngược xen kẽ nhau, tuy nhiên, chúng có một cặp xếp cùng chiều, ở chuỗi β – chitin các chuỗi sắp xếp theo một chiều nhất định, còn ở chuỗi γ – chitin có các cặp chuỗi xếp cùng chiều so le với một chuỗi ngược chiều trong cấu trúc.
![Hình 1.5. Cấu trúc chitin [61]](https://media.store123doc.com/figures/003/108/hinh-cau-truc-chitin-3108285.webp)
Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo thành enzyme của nấm sợi trên môi trường lên men bán rắn [14, 35, 36]
Nhiều nghiên cứu trên Trichoderma harzianum chỉ ra rằng pH thích hợp cho nấm này sinh trưởng tạo chitinase có hoạt tính cao khoảng pH = 4-6 (Nguyễn Thị Hồng Thương và các đồng tác giả, 2003). Nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp có thể kìm hãm sự sinh trưởng, thậm chí có thể giết chết sợi nấm, quá trình tổng hợp enzyme sẽ bị ức chế. Tuy nhiên trong các môi trường nuôi cấy vi sinh vật người ta đều bổ sung thêm cơ chất chitin nhằm tăng khả năng tạo chitinase.
Nhìn chung sự hiện diện của chitin trong môi trường nuôi cấy hữu ích cho việc tạo chitinase (Monreal và Reese, 1969; Ulhoa và Peberdy, 1993). Trong số các cơ chất, chitin huyền phù có khả năng kích thích tạo chitinase cao nhất (Bhushan, 2000; Nampoothiri và cộng sự, 2003). Năm 2003, Binod và cộng sự đã sử dụng nhiều cơ chất khác nhau (như vách tế bào nấm, vỏ tôm, cua ..) để tạo chitinase từ nấm sợi nuôi cấy trên môi trường bán rắn.
Những ứng dụng của enzyme chitinase [30, 33]
Các nhà khao học đã đề xuất một phương pháp chẩn đoán bệnh truyền nhiễm do nấm bằng cách sử dụng chitinase đã được phân lập tạo dòng từ Vibrio parahemolyticus (đặt tên chitinase VP1), enzyme này kết hợp chặt chẽ với chitin và có thể. Ngoài ra, chitinase có tiềm năng trong việc sản xuất các loại kem hay thuốc bôi ngoài da chứa chất chống nấm bệnh thường xảy ra các nước vùng nhiệt đới bởi khả năng phân hủy vách tế bào vi nấm của chúng. Vì chitin không phải là thành phần phổ biến ở thực vật và động vật có xương nên người ta sử dụng các tác nhân kìm hãm sự sinh tổng hợp chitin trong các nấm và côn trùng như 1-(2,6-dichlorobenzoyl)-3-(3,4-dichlorophenol), nikkomycin, polyoxin D ..Khi áp dụng trên cây cảnh, cây lương thực và trên động vật, những tác nhân trên chứng tỏ có nhiều ưu thế trong việc tiêu diệt nấm mốc, côn trùng có hại mà không gây hại đáng kể cho thực vật hoặc động vật có xương sống.
CHIT42, CHIT40 và CHIT72 từ Trichoderma harzianum P1 và Trichoderma virens 41 có thể tác động trên sự nảy mầm và sự kéo dài của sợi nấm của nhiều nấm gây bệnh thực vật như Fusarium spp., Alternaria spp., Ustilago avenae,. Aspergillus niger khi nuôi cấy trên môi trường thạch-khoai tây-dextrose ở 250C cho khuẩn lạc ban đầu màu trắng, sau nhanh chóng chuyển sang màu đen với việc tạo vô số bào tử đính, mặt trái khuẩn lạc màu hơi vàng nhạt và khi trưởng thành có thể tạo đường rãnh phóng xạ trên bề mặt thạch. Aspergillus awamori có bông mau chóng chuyển màu nâu hơi đỏ, mặt trái khuẩn lạc màu tương tự, cuống bào tử đính phần lớn phát triển dài 1,0-1,5mm, bào tử đính phần lớn đường kính 4,0 đến 4,5 àm.
SƠ LƯỢC CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CHITINASE 1. Trên thế giới
Trong nước
Nhìn chung những nghiên cứu về enzyme chitinase trong nước còn rất hạn chế cho dù tiềm năng ứng dụng rộng rãi của enzyme này là không thể phủ nhận. Năm 2001, tác giả Đinh Minh Hiệp có công trình nghiên cứu đặc tính của enzyme chitinase thu nhận từ nấm mật Coprinus fimentarius và một số ứng dụng trong lĩnh vực bảo vệ thực vật và y dược. Năm 2003, các tác giả Nguyễn Thị Hồng Thương, Đinh Minh Hiệp, Đồng Thị Thanh Thu có công trình nghiên cứu khảo sát một số yếu tố tác động lên quá trình sinh tổng hợp hệ enzyme chitinase của các chủng nấm mốc Trichodrema sp.
Năm 2004, tác giả Tô Duy Khương thực hiện đề tài khảo sát sự sinh tổng hợp chitinase ở Trichoderma spp. Năm 2008, tác giả Nguyễn Đình Nga và cộng sự khảo sát khả năng tác động lên nấm Candida albicans của enzyme chitinase thu nhận từ thực vật và từ nấm Trichoderma. Trên đối tượng thực vật, năm 2008, tác giả Đặng Trung Thành đã nghiên cứu quá trình thu nhận enzyme chitinase từ cây khoai lang Ipomoea batatas, thu enzyme chitinase có hoạt tính khá cao (hoạt độ đạt 192 UI/ml).
Nhìn chung, những nghiên cứu về chitinase trong nước chưa nhiều, chủ yếu vẫn trên nấm Trichoderma, ứng dụng chủ yếu mới đề cập đến trong lĩnh vực bảo vệ thực vật và khởi đầu trong lĩnh vực y dược.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Malt Extract Agar (YEA) [11,26]
DỤNG CỤ THIẾT BỊ HểA CHẤT .1 Dụng cụ
- Đèn cồn, diêm quẹt, que cấy, giấy lọc, giấy báo cũ, bông không thấm nước, bông thấm nước, đũa khuấy, phễu, ống đong, vải lọc ….
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên tắc: Nấm sợi sử dụng chất dinh dưỡng có sẵn trong môi trường để sinh trưởng, tổng hợp một lượng lớn enzyme ngoại bào lẫn trong môi trường, ta thu được sinh khối nấm sợi lẫn enzyme thô từ canh trường. Dùng giống trong ống thạch nghiêng, cho 10ml nước cất vô trùng vào mỗi ống, dùng que cấy cà đều bề mặt lấy hết bào tử tạo dạng huyền phù.Tiến hành đếm bào tử bằng buồng đếm hống cầu. Nguyên tắc: Dựa trên khả năng hòa tan trong nước của các enzyme, dùng nước cất hòa tan tạo dịch enzyme, sau đó dùng các tác nhân kết tủa khác nhau để kết tủa enzyme.
Phương pháp so màu là phương pháp phân tích dựa trên việc so sánh cường độ màu của dung dịch nghiên cứu với cường độ màu của dung dịch tiêu chuẩn có nồng độ xác định. Dùng phương pháp so màu chủ yếu để xác định lượng nhỏ các chất, phương pháp này cho phép tiết kiệm thời gian cùng kết quả chính xác cao so với các phương pháp khác. Khi enzyme phân hủy chitin tác dụng với cơ chất là chitin huyền phù, sản phẩm tạo thành là N-acetyl-β-D-Glucosamine được hiện màu với thuốc thử DNS (3,5-dinitrosalisylic acid) và đem đo mật độ quang ở bước sóng 535nm.
Do chitin không hòa tan trong nước nên để tiến hành xác định hoạt tính enzyme chitinase cần huyền phù hóa chitin: Lấy 5 gam chitin hòa tan trong 50ml HCl đậm đặc. Cho 1ml dịch enzyme vào ống nghiệm, nhỏ 1ml NaOH 1N, sau đó cho thêm 1ml dịch huyền phù chitin 1% vào, tiếp tục làm theo các bước tương tự như trên. Một đơn vị hoạt tính enzyme chitinase (đvht) là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1g N-acetyl-β-D-Glucosamine (NAG) từ chitin huyền phù trong thời gian 1 phút ở nhiệt độ phản ứng (500C).
Yếu tố môi trường ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh tổng hợp enzyme của nấm sợi như thời gian nuôi cấy, nhiệt độ môi trường nuôi, loại cơ chất cảm ứng. Khảo sát các yếu tố trên nhằm chọn ra điều kiện tối ưu để nuôi cấy chủng nấm sợi nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase có hoạt độ cao nhất. Để xác định điều kiện tối ưu cho quá trình nuôi cấy chủng nấm sợi chọn thu chế phẩm enzyme chitinase, chúng tôi dùng thực nghiệm yếu tố toàn phần.
Từ các kết quả thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng riêng lẻ từng yếu tố, chúng tôi chọn 3 yếu tố là thời gian nuôi cấy, nhiệt độ môi trường nuôi cấy và nồng độ chitin trong môi trường nuôi cấy để nghiên cứu tối ưu hóa theo phương pháp qui hoạch thực nghiệm.
Nsbisth
Phương pháp nghiên cứu các điều kiện hoạt động tối ưu của chế phẩm chitinase thu nhận từ một số chủng nấm sợi nghiên cứu
Tiến hành phản ứng với chitin huyền phù trong điều kiện nhiệt độ ủ tối ưu đã xác định ở mục 2.3.7a. Từ đó vẽ đồ thị biễu diễn sự biến thiên của lượng sản phẩm tạo thành (glucosamine) theo pH, tìm ra pH tối ưu của hoạt động chế phẩm. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng lên sản phẩm tạo thành của chế phẩm enzym chitinase.
Từ đó vẽ đồ thị biễu diễn sự biến thiên hàm lượng glucosamine tạo ra theo thời gian phản ứng, tìm ra thời gian phản ứng tối ưu của chế phẩm enzyme chitinase.