Xác định thành phần protein của Virus gây hội chứng đốm trắng WSSV

Mục đích của đề tài

Xác định thành phần protein của WSSV trong dịch tế bào côn trùng Sf9 nhiễm virus.

Mô hình cấu trúc hạt virion của WSSV

• Các con đường lây nhiễm

VP28 và VP19 thí ông cho rằng kháng thể chống lại VP28 giúp tôm chống lại bệnh rất hiệu quả còn kháng thể chống lại VP19 thí hầu nhƣ không có khả năng giúp tôm chống lại bệnh (Jeroen Witteveldt và cộng sự., 2003). Theo Marks và cộng sự (2003) cho đến nay WSSV đƣợc phân lập từ tôm penaeids ở các vùng địa lý khác nhau thí rất giống nhau về hính thái và protein chức năng, chỉ khác nhau một chút trong sự đa hính về độ dài đoạn giới hạn (restriction fragment length polymorphism - RFLP) chủ yếu do có nhiều đoạn chèn nhỏ (insertions) và một đoạn loại bỏ (deletion) lớn (khoảng 12 kbp) (Chen và cộng sự, 2002). Theo Dieu và ctv (2004), sự khác biệt nói trên đã đƣa đến một giả thuyết là đã có một sự phân nhánh virus từ một dòng tổ tiên bắt nguồn từ eo biển Đài Loan đến Thái Lan nhƣng cần tiến hành thêm nhiều phân tìch khác biệt giữa nhiều dòng ở các vùng địa lý khác nữa mới khẳng định đƣợc giả thuyết.

Các nhà khoa học này đã phân tìch RFLP tám dòng WSSV Việt Nam (VN), trong đó có 6 dòng thu từ bờ biển miền Trung và 2 dòng từ bờ biển miền Nam và cho thấy sự khác biệt trính tự ở các vị trì biến đổi đã đƣợc đề cập.  Lây lan theo chiều ngang (Horizontal transmission): bị nhiễm virus từ nguồn nước nuôi, từ cua, còng mang virus từ ao này sang ao kia, từ dùng cụ sản xuất còn mang mầm bệnh, từ tôm chết, do người hoặc chim, cò vô tính đưa vào ao,…(Trần Thị Việt Ngân, 2002).  Thời kỳ ấu niên đến trưởng thành: ăn tạp, thiên về thức ăn động vật như giáp xác, nhuyễn thể, giun nhiều tơ, cá nhỏ, một số loài rong tảo, mùng xác hữu cơ, xác động vật thực vật chết, thân hạt thực vật chết….

Trong hầu hết các trường hợp, nguồn gốc chình của việc phát sinh bệnh là vấn đề môi trường dù rằng trong bản thân nội tại của vật chủ có sự tồn tại của mầm bệnh, đây không nên xem là nguyên nhân chình sinh ra bệnh. Ví thế việc tăng cường sức đề kháng cho các đối tượng nuôi thủy sản thuộc nhóm giáp xác không thể dựa vào việc sử dụng các loại vaccin mà chủ yếu là các biện pháp tăng cường hiệu quả đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu thông qua cải thiện điều kiện môi trường nuôi và sử dụng các chất kìch thìch miễn dịch.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH

• Hóa chất và thuốc thử
• Phương pháp

Gel acrylamide là lưới gel được hính thành do các sợi polymer của acrylamide (polyacrylamide) liên kết lại với nhau bằng các cầu nối đồng hóa trị (khác với lưới gel của agarose là sự liên kết các sợi polymer phân tử đường bằng các cầu nối không đồng hóa trị). Trong hệ thống này, gel polyacrylamide đƣợc đổ thành 2 lớp, lớp ở trên có kìch thước lưới gel lớn và không hạn chế được gọi là lớp Stacking gel, lớp ở dưới là lớp gel để phân tách các thành phần protein chạy điện di được gọi là Running gel. Trong hệ thống đệm không liên tục này, khi bắt đầu điện di, các ion và thành phần protein di chuyển trước hết vào lớp Stacking gel, các thành phần protein tập trung thành một lớp mỏng giữa các ion dẫn đầu (leading ion) và các ion đi sau (trailing ion) và lớp mỏng protein này đƣợc di chuyển dần đến để tiếp cận lớp running gel.

Trong bước Western blotting, các band điện di từ gel được chuyển lên màng nitrocellulose bằng phương pháp sử dụng buồng (tank method): áp gel điện di lên trên màng nitrocellulose rồi cho chúng vào giữa hai tờ giấy thấm dầy rồi đƣa vào giữa lớp nylon bọt mềm. Khi áp điện thế vào giữa hai điện cực, các band protein trên gel điện di sẽ chịu tác động của lực điện trường để di chuyển về cực dương, nhờ vậy được chuyển rồi thấm lên màng nitrocellulose và được phát hiện bằng phương pháp miễn dịch. Tác giả sử dụng dịch tế bào côn trùng Sf9 nhiễm WSSV thu từ tôm biểu hiện hội chứng đốm trắng ở cần đước năm 1996 thế hệ thứ 3 (W-CĐP3), để gây nhiễm cho tôm sú 45 ngày tuổi bằng cách cho ăn và bơm vào môi trường nước.

 Trên cơ sở thì nghiệm này chúng tôi tiến hành lại thì nghiệm gây nhiễm cho cho tôm sú bằng cách tiêm W-CĐP7 và cho ăn mô tôm bị nhiễm WSSV để thăm dò khả năng gây nhiễm của WSSV đƣợc nhân lên trong dịch tế bào côn trùng Sf9 ở thế hệ thứ 7. Những phân tử có kìch thước đủ nhỏ để lọt vào bên trong lỗ gel sẽ bị trí hoãn và di chuyển chậm qua cột, trong khi những phân tử lớn hơn di chuyển bên ngoài các hạt gel nên sẽ di chuyển nhanh và đƣợc hấp (lôi) ra khỏi cột sớm hơn các phân tử nhỏ. Chuẩn bị gel. Nhƣng ví thể tìch gel sẽ bị mất trong suốt quá trính thao tác nên cần cân dƣ), cho bột gel từ từ vào dung dịch đệm phosphate đựng trong cốc.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬ N

• Kết quả điện di miễn dịch

Kết quả bảng trên cho thấy tất cả các phân lập: W-CĐP7, W-SP7, W-NP7, W- STP7 về cơ bản có các đặc trƣng protein giống với các protein của WSSV đã đƣợc công bố. Để khẳng định kết quả trên chúng tôi thực hiện kỹ thuật Western – Blotting để kiểm tra lại các vạch protein đƣợc xác định là của WSSV trong bảng SDS - PAGE. Kết quả điện di cho thấy phân lập W-STP7 có đầy đủ các vạch protein đại diện của các phân lập W-CĐP7, W-SP7 và W-NP7.

Các vạch protein trong bảng SDS – PAGE và điện di miễn dịch hoàn toàn giống nhau tuy nhiên có 2 vạch protein có trọng lƣợng khoảng 95 kDa và >103 kDa của bảng SDS – PAGE thí không xuất hiện trong bảng điện di miễn dịch có thể do trong quá trính chuyển thẩm tại vị trì hai vạch protein này có bọt khì làm cho màng nitrocellulose và miếng gel tiếp xúc không khìt nhau nên các protein này không thể chuyển lên màng nitrocellulose đƣợc, do đó kháng thể không gắn kết đƣợc nên không thấy vạch. Nhƣ vậy, chúng tôi nhận thấy ở các phân lập này đều có chung 2 vạch protein có trọng lƣợng khoảng 28 kDa , 31 kDa và 2 phân lập W-SP7, W-SN7 có các protein giống nhau. Để xem hoạt tình của WSSV đƣợc nhân sinh khối trong tế bào côn trùng Sf9 ở thế hệ thứ 7 có khả năng gây nhiễm trở lại trên tôm sú không.

Lô 3

• Tôm ở lô 2 C: Tôm ở lô 3

 Tôm ở lô 2 và lô 3 có những biểu hiện của bệnh Hội trứng đốm trắng ở tôm sú: Thân đỏ, tôm bỏ ăn, tôm thường đứng yên ìt cử động, vỏ đầu ngực có nhiều đốm trắng với đường kình khoảng 0,2 – 3 mm, vỏ tôm dình chặt với thịt và thân tôm rất mềm.  Kết quả thì nghiệm của chúng tôi đã cho ta thấy WSSV đƣợc nhân lên trong dịch tế bào côn trùng Sf9 ở thế hệ thứ 3 và thứ 7 đều có khả năng gây nhiễm trở lại tôm sú trong điều kiện phòng thì nghiệm là nhƣ nhau và điều gây chết tôm sau 23 ngày gây nhiễm. Nhƣ vậy, từ kết quả gây nhiễm thực nghiệm trên tôm sú, kết quả Dot - Blot chỉ thị protein virus và kết quả PCR đã cùng khẳng định rằng các protein của WSSV đƣợc nhân sinh khối qua tế bào côn trùng Sf9 ở thế hệ thứ 7 là có hoạt tình gây nhiễm trở lại trên tôm sú và hoạt tình gây nhiễm này không thay đổi so với các protein của WSSV đƣợc nhân sinh khối qua tế bào côn trùng Sf9 ở thế hệ thứ 3.

Tuy nhiên, hoạt tình gây nhiễm của các protein này yếu hơn so với các protein của WSSV trong mô tôm bệnh, có thể các protein của WSSV đƣợc nhân sinh khối đã quen nhận diện tế bào đìch để nó xâm nhập vào là tế bào côn trùng Sf9 nên khi gây nhiễm lại trên tôm chúng cần phải có thời gian để nhận diện tế bào tôm. Trên cơ sở điện di chúng tôi thấy các vạch protein riêng biệt như thế nên bước tiếp theo là chúng tôi tiến hành thăm dò khả năng phân tách từng vạch protein của WSSV với hy vọng thu đƣợc từng loại protein tinh sạch để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. Tiếp tục nghiên cứu khả năng biến đổi protein và bộ gen của WSSV nhân qua tế bào nhiều thế hệ và khả năng sử dụng dịch tế bào nhiễm WSSV nhƣ một kháng nguyên để gây tạo miễn dịch thu kháng thể phục vụ cho các ứng dụng chẩn đoán và phòng ngừa WSSV ở tôm nuôi.