Phương pháp chẩn đoán bệnh trên tôm trong nuôi trồng thủy sản
MỤC LỤC
Phương pháp chẩn đoán
- Phương pháp mô học: dấu hiệu định bệnh là sự xuất hiện của những thể vùi trong nhân tế bào của các mô có nguồn gốc trung bì. - Phương pháp lai tại chỗ ADN (In situ DNA hybridization): dấu hiệu định bệnh là kết quả lai giữa đoạn gen dùng làm mẫu dò và đoạn gen của tác nhân gây bệnh trong điều kiện nghiêm ngặt. - Phương pháp Dot blot và Southern blot: được thực hiện với sản phẩm khuếch đại của một đoạn gen đặc trưng của tác nhân.
Kỹ thuật này đã được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm và phát triển, đồng thời đưa ra các cải tiến mới như: Nested PCR, Semi – Nested PCR, Real - time PCR,…Với độ nhạy, độ đặc hiệu rất cao kết hợp với khả năng phát hiện và định lượng đồng thời, Real - time PCR được xem như một phương pháp rất có ý nghĩa trong việc xác định chính xác mức độ nhiễm mầm bệnh, đặc biệt là bệnh đốm trắng trên tôm.
Phương pháp PCR và các cải tiến 1. Phương pháp PCR
- Kỹ thuật Nested PCR
- Kỹ thuật Real - time PCR
Phương pháp dựa trên nguyên tắc PCR Nested, trước tiên khuếch đại một đoạn ADN trên bộ gen của vi sinh vật đích, sau đó khuếch đại một đoạn ADN bên trong sản phẩm khuếch đại đầu tiên này để có sản phẩm khuếch đại cuối cùng phát hiện được nhỏ hơn sản phẩm khuếch đại ban đầu (Phạm Hùng Vân, 2002). Tuy phương pháp này giúp gia tăng độ nhạy của PCR, nhưng Nested PCR vẫn đòi hỏi nhiều thời gian thực hiện, không có khả năng định lượng chính xác số bảo sao của sinh vật đớch và khụng thể theo dừi tiến trỡnh phản ứng đang diễn ra theo từng chu kỳ khuếch đại. Khi hai probe bắt cặp với đoạn ADN đích thường chúng được tách riêng ra và bắt cặp vào ở vị trí cách nhau 1 - 5 nucleotide, kết quả sẽ có hiện tượng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET) giữa hai chất chỉ thị huỳnh quang.
Khi phản ứng Real - time PCR kết thúc, giá trị chu kỳ ngưỡng của mẫu xét nghiệm và của các chuẩn được xác định ở thời điểm có sự tương quan tuyến tính giữa số chu kỳ và nồng độ huỳnh quang đo được (pha log hay pha cấp số).
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu 1. Mẫu xét nghiệm
- Trang thiết bị, dụng cụ và hoá chất 1. Trang thiết bị và dụng cụ
- 50 ống eppendorf, mỗi ống cú chứa sẵn 48 àl hỗn hợp Real - time PCR gồm cỏc thành phần: primer, dNTP, Taq polymerase, TaqMan probe, Mg2+, dung dịch đệm PCR. - Bộ thuốc thử ly trích thô ADN ở tôm với các thành phần tương tự như bộ thuốc thử ly trích thô ADN ở tôm đi kèm trong bộ kit “Real - time PCR phát hiện WSSV trên tôm”. - 50 ống eppendorf, mỗi ống cú chứa sẵn 48 àl hỗn hợp Non Stop Nested PCR gồm các thành phần: dung dịch đệm PCR, Taq polymerase, dNTP, primer, Mg2+, UNG và dUTP.
Các hạt nhỏ này sẽ gắn kết với ion hóa trị hai (các ion này hỗ trợ enzyme phân giải ADN mẫu) trong dịch tách chiết ADN, nhờ đó các ion hóa trị hai được loại bỏ.
Phương pháp nghiên cứu 1. Thu mẫu và bảo quản mẫu
- Ly trích mẫu
- Tiến hành thực hiện Real - time PCR
- Thực hiện Non Stop Nested PCR
- Cách đọc kết quả 1. Real - time PCR
Sau đú tiếp tục thờm 500 – 700 àl dung dịch tỏch chiết, tiếp tục nghiền cho đến khi thấy mẫu được nghiền nhuyễn hoàn toàn (có thể gắn chày vào một đầu khoan điện để nghiền cho nhanh). Phân tích kết quả dựa vào đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ, đồ thị biểu diễn đường chuẩn, bảng kết quả chạy mẫu (chi tiết ở mục 3.4.5.1). - Sử dụng micropipette hỳt 2 àl dung dịch tỏch chiết ADN của mẫu cần phõn tớch cho vào ống eppendorf cú chứa sẵn 48 àl hỗn hợp Non Stop Nested PCR để đạt thể tích phản ứng sau cùng là 50 l.
Kết quả kiểm tra mẫu qua Real - time PCR được phân tích qua đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ, đồ thị biểu diễn đường chuẩn, bảng kết quả chạy mẫu. Trong suốt thời gian chạy chương trình Real - time PCR, ta có thể nhận biết sự biểu hiện nồng độ ADN của WSSV trong các mẫu thử bằng cách quan sát các đường biểu diễn nồng độ huỳnh quang trên màn hình vi tính. Chu kỳ ngưỡng được xác định khi đường baseline subtracted cắt tất cả các đường biểu diễn nồng độ huỳnh quang của mẫu kiểm tra trong giai đoạn tuyến tính giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ (pha log).
Đường chuẩn được dựng nên từ 5 chuẩn ở Hình 3.6 với trục tung: chu kỳ ngưỡng - Ct (threshold cycle) và trục hoành: giá trị logarit của số lượng bản sao ban đầu (Log Starting Quantity) có đơn vị là số bản sao (copy number). Các thông số cần phân tích thể hiện trên đường chuẩn bao gồm: hệ số tương quan (r2) (correlation coefficient), hiệu quả phản ứng (PCR efficiency) và độ nghiêng (slope). Điều này do các giá trị được đo ở giai đoạn không có sự tuyến tính giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ hay do sự hiện diện của các chất ức chế trong phản ứng (Qiagen, 2004).
Nếu có sự lặp lại các mẫu, kết quả còn được phân tích qua số bản sao trung bình (SQ Mean), giá trị chu kỳ ngưỡng trung bình (Ct Mean), độ lệch chuẩn của số bản sao ban đầu (SQ SD), độ lệch chuẩn của chu kỳ ngưỡng (Ct SD). Kết quả sau khi thực hiện Non Stop Nested PCR được phân tích dựa trên kích thước đoạn khuếch đại đặc hiệu và thang ADN chuẩn qua quan sát các băng ADN dưới tia sáng của đèn UV hay bằng máy phân tích điện di GelDoc iQ của Bio – Rad.
Bố trí thí nghiệm
Dựa vào kết quả so sánh chu kỳ ngưỡng của mẫu ở từng nồng độ pha loãng theo hai quy trình ly trích để xác định mẫu ly trích theo quy trình nào sẽ có ADN đích nhiều và tinh sạch hơn (mẫu có ADN đích nhiều và tinh sạch hơn sẽ có chu kỳ ngưỡng thấp hơn). Thí nghiệm 2: sử dụng phương pháp Real - time PCR kiểm tra phát hiện và định lượng virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên 15 mẫu đã xác định dương tính, âm tính với WSSV. Sau khi ly trớch xong, dựng micropipette hỳt 2 àl dịch tỏch chiết chứa ADN của WSSV cho vào từng hỗn hợp 48 àl Real - time PCR và hỗn hợp 48 àl Non Stop Nested PCR.
Kết quả chạy Real - time PCR được đối chiếu với kết quả chạy Non Stop Nested PCR và so sánh với kết quả đã xét nghiệm trước đó bằng phương pháp PCR và Semi – Nested PCR. Sau khi ly trích xong, pha loãng dịch tách chiết ADN của hai mẫu này theo hệ số pha loãng bậc 10 (giống như tiến hành pha loãng mẫu ở thí nghiệm 1) được một dãy các nồng độ ADN theo chiều giảm dần từ 100 đến 10-3. Dựa vào các đường biễu diễn nồng độ huỳnh quang ở từng nồng độ trên đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ, độ sai khác của các giá trị chu kỳ ngưỡng ở các nồng độ, độ lệch chu kỳ ngưỡng trung bình và độ lệch giữa các số bản sao trung bình ở các nồng độ pha loãng qua 3 lần lặp lại để xác định tính tuyến tính về khả năng định lượng của Real - time PCR.
Căn cứ vào đường biểu diễn nồng độ huỳnh quang ở 3 lần lặp lại của từng nồng độ mẫu pha loãng, log số lượng bản sao ban đầu của mẫu ở từng nồng độ pha loãng trên đồ thị biểu diễn đường chuẩn, độ sai khác chu kỳ ngưỡng của 3 lần lặp lại ở cùng nồng độ pha loãng, độ lệch chuẩn của số bản sao ban đầu qua 3 lần lặp lại để xác định độ lặp lại về khả năng định lượng của Real - time PCR. So sánh độ nhạy giữa hai phương pháp để khẳng định tính vượt trội về độ nhạy của phương pháp Real - time PCR nhằm sử dụng để kiểm tra phát hiện WSSV trên các mẫu thu từ thực tế. Sau khi ly trích xong, dịch tách chiết ADN được tiến hành pha loãng theo hệ số pha loãng bậc 10, được một dãy các nồng độ ADN bản mẫu theo chiều giảm dần từ 100 đến 10-8.
Dựa vào đường biểu diễn nồng độ huỳnh quang của các mẫu trên đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ và các hiển thị của mẫu trên đồ thị biểu diễn đường chuẩn để xác định là mẫu dương tính hay âm tính với WSSV và số lượng bản sao ban đầu của WSSV. Ghi nhận lại kết quả thu hoạch của các ao tôm thả nuôi tôm giống hoặc đang nuôi tôm thương phẩm, sản xuất giống bằng tôm bố mẹ được xét nghiệm bằng phương pháp Real - time PCR cho kết quả âm tính và dương tính với WSSV.
