Nghiên cứu cơ chế kháng đa thuốc ở vi khuẩn lao bằng kỹ thuật sinh học phân tử: Đột biến gen rpoB và katG
MỤC LỤC
Nguyên nhân gây kháng thuốc
Còn hiện tượng kháng thuốc thứ phát xảy ra đối với các chủng vi khuẩn lao ở bệnh nhân nào đó dùng thuốc chống lao không đúng quy định, không đúng liều lượng, thời gian sử dụng thuốc do đó đã chọn lọc vi khuẩn lao khang thuốc [1, 38]. Trong luận văn này, chúng tôi tập trung nghiên cứu cơ chế kháng đa thuốc, tức là trường hợp vi khuẩn lao kháng đồng thời hai thuốc chống lao mạnh nhất hiện nay là isoniazid và rifampicin, điều đó đồng nghĩa với việc nghiên cứu các đột biến trên gen rpoB với katG.
Rifampicin và cơ chế kháng
- Khi xảy ra đụ̣t biến gần vựng lừi của gen rpoB sẽ làm thay đụ̉i cấu trỳc tiểu phần β của RNA polymerase mà nó mã hóa nên làm cho khả năng kết hợp của RMP với tiểu phần này giảm đi. Điều này cho thấy cần phải xác định thêm những đột biến khác trên gen này hoặc những gen khác có liên quan để xác định chính xác và toàn bộ cơ chế kháng rifampicin của vi khuẩn lao [19, 37].
![Hình 1.6. Cấu trúc tinh thể liên kết giữa rifampicin và RNA polymerase [20]](https://media.store123doc.com/figures/004/155/hinh-cau-truc-the-lien-giua-rifampicin-polymerase-4155947.webp)
Isoniazid và cơ chế kháng
Cơ chế phân tử của tính kháng INH chủ yếu có liên quan tới đột biến thêm đoạn/mất đoạn hoặc các đột biến nhầm nghĩa/vô nghĩa, trong đó chủ yếu diễn ra tại codon 315 (Ser à Thr) của gen katG mã hóa catalase peroxidase [26]. Nếu có sự biến dạng hay đột biến ở base thứ 2 tại codon 315 của gen katG (AGC biến đổi thành ACC hay ACA) sẽ dẫn đến làm giảm hoặc mất hoàn toàn hoạt tính của catalase peroxidase, do đó M.
CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN LAO KHÁNG THUỐC 1. Đặc điểm lâm sàng và các xét nghiệm cận lâm sàng
Xác định kiểu hình
Gồm các phương pháp sau: Phương pháp xác định tương quan, phương pháp xác định tỷ lệ kháng, phương pháp đo màu, phương pháp khử nitrate và nhiều phương pháp khác [13]. Các phương pháp này đều xác định khả năng phát triển của vi khuẩn lao trong môi trường nuôi cấy có kháng sinh, từ đó đưa ra kết luận về khả năng kháng thuốc của chủng vi khuẩn lao đang nghiên cứu [12].
Xác định kiểu gen
Sau khi giải trình tự đoạn gen vừa được tách dòng từ chủng lao nghiên cứu ta sẽ so sánh trật tự sắp xếp các nucleotide ở mẫu thí nghiệm với trật tự nucleotide chuẩn để biết được các vị trí sai lệch [22, 16]. Việc xác định các đột biến có liên quan kháng thuốc rifampicin và isoniazid bằng kỹ thuật giải trình tự cho biết chính xác vị trí đột biến cũ và mới trên gen cần nghiên cứu, mang lại hiểu biết sâu sắc về sự đa dạng của cấu trúc quần thể vi khuẩn lao ở bệnh nhân lao kháng thuốc, đánh giá được tỷ lệ đột biến liên quan kháng thuốc trên các chủng lao phân lập từ các vùng địa lý khác nhau.
Kỹ thuật real-time PCR và multiplex real-time PCR
Sau khi giải trình tự đoạn gen vừa được tách dòng từ chủng lao nghiên cứu ta sẽ so sánh trật tự sắp xếp các nucleotide ở mẫu thí nghiệm với trật tự nucleotide chuẩn để biết được các vị trí sai lệch [22, 16]. Việc xác định các đột biến có liên quan kháng thuốc rifampicin và isoniazid bằng kỹ thuật giải trình tự cho biết chính xác vị trí đột biến cũ và mới trên gen cần nghiên cứu, mang lại hiểu biết sâu sắc về sự đa dạng của cấu trúc quần thể vi khuẩn lao ở bệnh nhân lao kháng thuốc, đánh giá được tỷ lệ đột biến liên quan kháng thuốc trên các chủng lao phân lập từ các vùng địa lý khác nhau. Qua đó làm tiền đề xây dựng một số bộ kit real-time PCR, nhằm phát hiện nhanh vi khuẩn lao kháng rifampicin và isoniazid tại Việt Nam. khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích). Khi bắt đầu có sự xuất hiện sản phẩm khuếch đại đặc hiệu thì Taqman probe sẽ bắt cặp vào sợi khuôn của sản phẩm này ở giai đoạn nhiệt độ bắt cặp và sẽ bị Taq polymerase cắt bỏ để kéo dài mồi tổng hợp nên sợi bổ sung, do vậy reporter của Taqman probe sẽ bị cắt rời xa quencher và phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 1. Đối tượng nghiên cứu
Các chủng vi khuẩn lao nhạy cảm với thuốc kháng sinh, kháng đơn thuốc (kháng một loại thuốc INH hoặc RIF), kháng đa thuốc (kháng ít nhất hai loại thuốc dòng thứ nhất là INH và RIF) và siêu kháng thuốc (kháng tất cả các thuốc chống lao hiện tại) được thu thập từ các vùng miền khác nhau như Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch (TP Hồ Chí Minh), Bệnh viện Trung ương Huế và bệnh viện Lao và Bệnh phổi Trung ương. Các chủng lao được phân lập từ các loại bệnh phẩm của bệnh nhân lao như: đờm, dịch màng phổi, dịch rửa phế quản, dịch màng bụng. Nồng độ DNA được đo trên máy NanoDrop® để tính và tạo các nồng độ DNA của các mẫu như nhau để khi đưa vào hỗn hợp phản ứng PCR cùng một thể tích DNA khuôn, và đạt khoảng 100 ng/thể tớch 25àl phản ứng.
Kết quả đo nồng độ DNA tổng số của từng mẫu nghiên cứu được trình bày trong phần phụ lục 2.
H/c sinh phẩm dùng trong tách dòng Pepton
- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Sơ đồ nghiên cứu
STT Thành phần Nồng đụ̣ Thể tớch (àl). DNA vi khuẩn lao. Gắn gen đích vào vector pBT. Đọc trình tự. Amp Thiết kế mồi. So sánh và phân tích kết quả nhận được. Thiết kế các probe phát hiện đột biến. Multiplex real time PCR BamHI BamHI. Theo chu kỳ nhiệt như sau. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng chạy điện di trên gel agarose 0,8%. Để phục vụ cho giải trình tự gen, đoạn gen katG và rpoB được tinh sạch và dòng hóa vào vector tách dòng pBT để tạo vector tái tổ hợp. Tạo dòng gen. *) Tạo sản phẩm nối ghép. Sau khi tách dòng và giải trình tự đoạn gen katG và rpoB của các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu được phân lập tại các vùng miền khác nhau tại Việt Nam, qua phân tích các đột biến, các probe sẽ được thiết kế nhằm phát hiện các đột biến có liên quan kháng INH và RIF ở vi khuẩn lao bằng phản ứng multiplex real-time PCR. Probe dùng cho phản ứng real-time PCR sử dụng cho nghiên cứu này được thiết kế theo công nghệ TaqMan MGB (Minor Groove Binding) probe (TaqManR Chemistry) của hãng Applied Biosystems dạng TaqMan này có ưu điểm đó là có thể thực hiện phản ứng real-time PCR ở nhiệt độ cao, từ đó làm tăng độ đặc hiệu của các probe.
Các quencher được gắn ở đầu 3’ của mỗi probe là các BHQ phát nhiệt, các BHQ phát nhiệt hiện nay được ưa chuộng sử dụng vì khả năng hấp thụ huỳnh quang rất mạnh, các BHQ được xem như các lỗ đen (black hole quencher – BHQ) hút lấy tất cả các huỳnh quang từ reporter không cho bất cứ huỳnh quang nào phát ra được từ reporter, đồng thời rất dễ dàng để thiết kế các Taqman probe dùng cho multiplex real-time PCR mà không lo đến phổ huỳnh quang của các reporter có bị trùng với phổ huỳnh quang của quencher vì quencher không hề phát huỳnh quang.
Ống 2
Ống 2 Thành phần Nồng độ
Trước tiên, để hiểu một cách chi tiết hơn về phương pháp xác định đột biến bằng kỹ thuật real-time PCR nói chung và chìa khóa để phân tích kết quả thu được, người làm thí nghiợ̀m cần hiểu rừ mụ̣t sụ́ khái niợ̀m về chu kỳ ngưỡng (threshold cycle – Ct) và khái niợ̀m về đường tín hiệu huỳnh quang nền trong real-time PCR. Đối với các mẫu xảy ra đột biến, do probe không gắn được vào sợi DNA đích và Taq polymerase không thể cắt bỏ các probe này, do vậy huỳnh quang phát ra từ reporter sẽ bị quencher của probe hấp phụ (dập tắt tín hiệu) do đó ống thử nghiệm sẽ không phát được tín hiệu huỳnh quang vượt qua tín hiệu huỳnh quang nền. Sau khi thiết lập thành công đường tín hiệu huỳnh quang nền để đưa ra kết luận chẩn đoán, chúng tôi tiến hành thử nghiệm phản ứng multiplex real-time PCR đã tối ưu đối với các mẫu DNA từ vi khuẩn lao đã được giải trình tự trước đó (do Học viện Quân y cung cấp được trình bày trong phần phụ lục 2).
Từ bảng tổng hợp kết quả thử nghiệm phản ứng multiplex real-time PCR phát hiện đột biến ở trên, chúng tôi tiến hành so sánh với kết quả xác định trình tự và nhận thấy rằng kết quả phát hiện đột biến của phản ứng multiplex real-time PCR có độ tương đồng 100% so với phương pháp giải trình tự.
