Nghiên cứu kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn dạng cọng rạ phục vụ cho tạo giống lợn

Vai trò của lợn đực giống và thụ tinh nhân tạo trong chăn nuôi lợn ở nước ta

Ảnh hưởng của đực giống đến đời sau không chỉ ở phạm vi số lƣợng mà cả ở chất lƣợng, nhiều tính trạng trội của đực giống thường được biểu hiện ở đời con như: màu sắc lông, da, thể chất khoẻ mạnh, tính cao sản, sức miễn kháng với bệnh tật. Hiện nay, với sự kế thừa thành tựu của các lĩnh vực sinh lý học, di truyền học, dinh dƣỡng gia súc…… và kết hợp với thực tế chăn nuôi lợn nói chung, chăn nuôi lợn đực giống nói riêng đã không ngừng đƣợc cải thiện và hoàn thiện.

Cơ sở của những nghiên cứu về tinh dịch và tinh trùng lợn 1. Sinh lý sinh dục gia súc đực

Cơ sở khoa học của kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn

Khi đóng băng các tinh thể hình thành, thể tích của chúng sẽ tăng, sự giãn nở thể tích này giải phóng năng lượng tiềm ẩn trong các phân tử nước làm cho nhiệt độ của dung dịch tăng đến điểm đóng băng mặc dù quá trình làm lạnh vẫn tiếp tục (Iritani, 1989) [27]. Khi đông lạnh tinh dịch, sự tạo thành nhân tinh thể và giãn nở của tinh thể băng chỉ xảy ra trong điều kiện đông lạnh chậm, còn khi đông lạnh cực nhanh thì hai hiện tƣợng trên không xảy ra mà xảy ra hiện tƣợng tinh thể hoá (vitrification) tạo ra các hạt băng nhỏ li ti, loại trừ đƣợc hiện tƣợng giãn nở tinh thể (Iritani, 1989) [27]. Vấn đề đặt ra là tốc độ làm lạnh phải đủ chậm cho sự mất nước tế bào, tránh đóng băng nước nội bào, nhưng quá trình này cũng phải đủ nhanh để tránh gây ra hiện tượng chênh lệch ASTT giữa môi trường ngoại bào và nội bào, dễ dẫn đến hiện tượng mất nước nghiêm trọng.

Quá trình giải đông cũng nhƣ đông lạnh đều có tác dụng cơ học huỷ hoại tinh trùng do sự chênh lệch áp suất tinh thể, sự di chuyển của nước qua màng tế bào tinh trùng và sự giãn nở của các tinh thể nước đá hay các bọt khí giữa các phân tử nước đá gây ra hiện tượng bất thường: méo mó, vỡ màng. Nó còn có khả năng kìm hãm hoạt động của một số vi khuẩn và nhiều loại enzym có hại cho tinh trùng, hạn chế quá trình trao đổi chất trong tinh dịch (nhất là quá trình phân huỷ), giúp cho tinh trùng duy trì hàm lƣợng ATP, ADP ở mức độ cao, duy trì đƣợc trạng thái tiềm sinh của tinh trùng.

Tình hình nghiên cứu đông lạnh tinh dịch lợn trong nước và ngoài nước 1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Bởi vậy, nhiều cố gắng trong thời gian dài nhằm làm sáng tỏ các vấn đề liên quan đến đông lạnh và giải đông tinh dịch, nhƣ: nguyên nhân thực tế, hạ giá thành sản phẩm, sự đồng đều trong sức sống của tinh trùng. Việc phát minh ra cơ chế tác dụng của Glyxeryl, Ethylenglycol và lòng đỏ trứng gà trước đây đã thúc đẩy sự phát triển của công nghệ này thì ngày nay với kỹ thuật tiên tiến người ta đã có thêm những hoá chất mới nhƣ Tris, BSA, Hepes là những dung dịch pha sẵn không cần đến lòng đỏ trứng gà. - Dụng cụ thí nghiệm : hệ thống kiểm tra đánh giá chất lƣợng tinh dịch (Computerized Digital Semen Analysis), bao gồm: máy vi tính có cài phần mềm Sperm Vision 3.0, kính hiển vi phản pha có camera tốc độ cao.

Tủ bảo ôn, máy ly tâm lạnh, máy đo áp lực thẩm thấu osmometer, máy đếm tinh trùng SDM-5, máy đo pH (pH meter), bình nitơ, dụng cụ đông lạnh, micropipet, cọng rạ 5ml dùng cho đông lạnh tinh dịch lợn của hãng Minitab. - Địa điểm: nghiên cứu đƣợc tiến hành tại Phòng thí nghiệm bộ môn Sinh lý sinh hoá và tập tính vật nuôi, Phòng nghiên cứu tế bào động vật, Trung tâm thực nghiệm và bảo tồn vật nuôi- Viện chăn nuôi.

Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chúng ta nhận thấy acrosome của tinh trùng phát ra quầng sáng ở phía đầu, đó là tinh trùng còn nguyên acrosome, những tinh trùng mà acrosome bị tổn thương sẽ không có quầng sáng này. Đánh giá chất lƣợng tinh trùng sau ly tâm để có sự so sánh về chất lƣợng tinh trùng giữa chế độ ly tâm 1 và 2 cũng nhƣ chất lƣợng tinh trùng sau ly tâm ở hai chế độ so với trước khi ly tâm. Hỗn hợp sau khi pha loãng và cân bằng ở bước 1 được pha loãng với môi trường L.Y.E.2, mức pha loãng bằng 1/3 thể tích cuối cùng, dung dịch L.Y.E.2 đƣợc chia làm 4 lần pha với hỗn hợp trên, mỗi lần cách nhau 15 phút.

Tinh dịch sau cân bằng bước 2 được đóng thành các cọng rạ maxi - straw có thể tích 5 ml/cọng rạ với tổng số tinh trùng có trong 1 cọng rạ là 5x 109 tinh trùng (nồng độ 1x 109 tinh trùng/1ml), bằng cách dùng seringe hút tinh dịch sau đó bơm vào các cọng rạ. Cọng rạ chứa tinh dịch đã cân bằng đƣợc để trong hơi nitơ lỏng, cách mặt nitơ lỏng 15cm (nhiệt độ đạt khoảng -79oC) trong thời gian 10 phút và 20 phút, sau đó đƣợc đƣa xuống nitơ lỏng ở nhiệt độ - 196oC.

Phương pháp xử lý số liệu

Sau khi bảo quản đánh giá sức sống của tinh trùng ở các thời gian đông lạnh khác nhau để tìm ra thời gian đông lạnh thích hợp. Đánh giá sức sống của tinh trùng ở hai thời gian giải đông 45 giây và 30 giây để tìm ra thời gian giải đông tối ƣu nhất. Tinh dịch đông lạnh sau khi giải đông đƣợc dùng trong kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm để tạo phôi.

Sử dụng tinh dịch lợn đông lạnh phối giống cho lợn nái trong sản xuất - Giải đông tinh dịch đông lạnh. - Pha loãng tinh dịch đã giải đông trước khi sử dụng : Sử dụng 80 ml môi trường VCN để pha loãng 5 ml tinh đông lạnh đã giải đông để phối giống cho lợn nái.

Kết quả nghiên cứu về một số chỉ tiêu chất lượng tinh dịch lợn trước khi đông lạnh

Nồng độ tinh trùng ở lợn Landrace 196 tr/ml; Yorkshire 112 tr/ml, thì kết quả nghiên cứu của chúng tôi bằng và cao hơn kết quả nghiên cứu của các tác giả trên. Halfer (1976) trích dẫn theo Nguyễn Tấn Anh [4] tỷ lệ kỳ hình của tinh trùng dao động từ 10-30%, nhƣ vậy kết quả nghiên cứu của chúng tôi nằm trong phạm vi nghiên cứu của các tác giả trên. Ngoài những chỉ tiêu đánh giá chất lƣợng tinh dịch ở trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu hoạt động của tinh trùng thông qua các chỉ tiêu: khoảng cách của cỏc dạng chuyển động của tinh trựng: DCL (àm); DAP (àm); DSL (àm).

Qua bảng 3.2 hầu hết các chỉ tiêu trên của lợn Landrace cao nhất, sự sai khác giữa các giá trị trung bình của các chỉ tiêu so với các giống còn lại có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Nhƣ vậy, kết quả thu đƣợc từ các chỉ tiêu chất lƣợng tinh dịch, những giống lợn sử dụng trong nghiên cứu này có chất lƣợng tinh dịch tốt, đạt tiêu chuẩn trong kỹ thuật thụ tinh nhân tạo theo tiêu chuẩn TCVN, 1959-76 [17] và đây là nguyên liệu đầu vào đạt tiêu chuẩn tốt trong kỹ thuật đông lạnh tinh dịch.

Kết quả nghiên cứu về kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn 1.Kết quả nghiên cứu kỹ thuật ly tâm

Tuy nhiên, căn cứ vào kết quả nghiên cứu trên, trong thí nghiệm này chúng tôi chỉ sử dụng môi trường VCN để làm môi trường ly tâm nhằm đánh giá ảnh hưởng của môi trường ly tâm đến sức sống tinh trùng của các giống lợn. Kết quả nghiên cứu ở lợn Duroc cũng cho nhận xét tương tự: các giá trị trung bình của các chỉ tiêu đánh giá sức sống tinh trùng Motility (%), A (Progressive Motility %) ở tinh pha và tinh nguyên có sự sai khác (p<0,05), nhƣng ở các chỉ tiêu còn lại có sự sai khác (p<0,01). Môi trường L.Y.E 1 và L.Y.E 2 là môi trường quan trọng nhất trong quá trình đông lạnh, các thành phần trong môi trường giúp cho trinh trùng chống đƣợc choáng lạnh, không bị teo hoặc vỡ, đảm bảo cho tinh trùng ở trạng thái tiềm sinh trong quá trình đông lạnh.

Tinh dịch các giống lợn Landrace, Yorkshire, Duroc đƣợc đông lạnh theo quy trình dựa trên các kết quả nghiên cứu trên: tinh nguyên đƣợc pha với môi trường VCN; ly tâm ở nhiệt độ 220C trong thời gian 15 phút với tốc độ ly tâm 1500 v/phút; cân bằng theo phương pháp 2 bước với môi trường L.Y.E 1 và L.Y.E 2; tinh dịch đƣợc đóng gói trong cọng rạ có thể tích 5ml (maxi - straw), thời gian đông lạnh trên hơi nitơ lỏng là 10 phút; bảo quản trong nitơ lỏng ( -196oC) và đƣợc giải đông ở nhiệt độ 52oC trong thời gian 45giây. Để tiếp tục đánh giá chất lƣợng tinh dịch đông lạnh, chúng tôi tiến hành nghiên cứu thử nghiệm sử dụng tinh đông lạnh để tạo phôi trong thụ tinh ống nghiệm, phối giống cho lợn nái để tạo phôi phục vụ kỹ thuật di thực phôi trên lợn và phối giống trực tiếp cho lợn nái trong sản xuất.

Kết quả nghiên cứu sử dụng tinh dịch lợn đông lạnh

Qua biểu đồ ở hình 3.11; 3.12, các chỉ tiêu vận động của tinh trùng ở Landrace thấp nhất, Yorkshire cao nhất và Duroc ở mức trung bình so với hai giống lợn trên.