Đánh giá năng lực bắt aflatoxin G1 của cột ái lực miễn dịch do Viện Pasteur TP.HCM sản xuất

Lấy mẫu

Thông thường, tuỳ theo loại thực phẩm và khối lượng thực phẩm cần phân tích, việc lấy mẫu được thực hiện từ nhiều vị trí khác nhau với những lượng khác nhau. Các mẫu này được tiến hành đồng nhất và từ mẫu đồng nhất này, một lượng thích hợp sẽ được trích ra để tiến hành phân tích aflatoxin, thường từ 20-100g tuỳ thuộc vào loại thực phẩm và hàm lượng aflatoxin cao hay thấp trong mẫu. Sự lựa chọn dung môi cho việc chiết mẫu tuỳ thuộc vào tính chất hóa học của aflatoxin cũng như tính chất của các thành phần khác.

Đối với mẫu có thành phần béo từ 5% trở lên, sử dụng các dung môi: hexane, petrolium ether, ethyl dioxide, pentane hoặc isooctane nhằm tách chất béo trước khi tiến hành chiết aflatoxin. Chiết aflatoxin: do aflatoxin tan được trong các dung môi hơi phân cực và không tan trong những dung môi phân cực cao, nên chúng thường được chiết với các dung môi hữu cơ như dichloromethane, benzene, acetonitril, acetone, chloroform, hay methanol. Thông thường, hỗn hợp dung môi hoặc những dung môi với một lượng nhỏ nước và acid được thấy là hữu hiệu nhất.

Trong khi độ hoà tan của aflatoxin trong nước thấp, dung môi có nước có thể thấm vào các mô ưa nước làm cho sự chiết tách hữu hiệu hơn. Quá trình này có thể thực hiện ở nhiệt độ phòng bằng cách lắc thông thường trong 30 phút hoặc dùng máy xay tốc độ cao trong 1-3 phút.

Làm sạch mẫu

 Phương pháp chiết pha lỏng-lỏng: thực hiện trong phễu chiết bằng cách chuyển aflatoxin từ dung môi chiết (acetone hay methanol) vào dung môi khác (ví dụ như chloroform).  Loại tạp bằng sắc kí hấp phụ: Kĩ thuật này hiện nay đã được phát triển và dùng rất nhiều do ưu điểm dễ sử dụng và hiệu quả loại tạp rất tốt trên nhiều loại mẫu khác nhau. Ví dụ, cột chiết xuất pha rắn SPE (solid-phase extraction) được chế tạo sẵn chứa các chất nhồi LC-CN có khả năng bắt tốt các aflatoxin ở hàm lượng thấp.

Tuy vậy, với những giá rắn từ các chất không phân cực như: C18, C8, C2, cyclohexyl, phenyl, florisil…liên kết với aflatoxin hoặc với các tạp chất theo cơ chế kỵ nước không có tính chọn lọc, phân giải kém trong nhiều trường hợp, và không lý tưởng khi aflatoxin chiếm tỉ lệ nhỏ so với tạp chất [14]. Chất chiết sau khi được làm sạch thường được cô đặc bằng cách cho bốc hơi trong máy cô quay (Rotary Evaporator) dưới áp suất thấp hoặc dùng nồi chưng cách thủy dưới luồng khí nitơ nhẹ. Các phương pháp sắc kí thường được sử dụng, dựa trên nguyên tắc phân tách giữa 2 pha: pha tĩnh và pha động (lỏng hoặc khí) khi cho chất cần tách qua lớp sắc kí.

Pha tĩnh có tính liên kết với aflatoxin làm chậm sự di chuyển của các chất (do các đặc điểm lí hóa khác nhau) nên tạo ra sự phân biệt giữa chúng. So sánh với một cột chuẩn chứa lượng AFT đã biết, ta có thể đánh giá mẫu chứa AFT ít hay nhiều hơn so với chuẩn. Pha tĩnh là một lớp mỏng chất có tính hấp phụ, thường là silicagel, được phết lên một bản mỏng (nhôm hoặc nhựa).

Pha động là dung môi chứa chất cần khảo sát được cho chạy qua lớp mỏng chất hấp phụ nhờ lực mao quản. Dịch chiết được chấm lên bản mỏng thành các đốm với thể tích thường là 2, 5, 10 àl; đốm chuẩn cũng được nhỏ lên cùng bản mỏng. Sau đó, bản mỏng được cho vào dung môi khai triển để các đơn chất trong hỗn hợp có thể tách rời nhau khi di chuyển bằng lực mao quản.

Dùng máy densitometer hay mắt để so sánh cường độ sáng của các đốm mẫu và đốm chuẩn, từ đó suy ra nồng độ aflatoxin trong mẫu. Densitometer cho độ chính xác cao hơn nhưng không thông dụng cho các phòng thí nghiệm địa phương. Cột sắc kí pha tĩnh có độ phân cực thấp sẽ có ái lực lớn với AFT, sẽ giữ hết AFT trên cột, dung môi pha động có độ phân.

Phương pháp nghiên cứu

• Các phương pháp phục vụ cho nghiên cứu
• Khảo sát các chỉ tiêu

 Dung môi phải được giữ trong những thiết bị không thấm nước, đục, tránh ánh sáng và để trong tủ lạnh.  Để tránh thất thoát aflatoxin do bị hấp thu, tất cả thiết bị thủy tinh dùng trong thao tác phải được ngâm trong dung dịch acid loãng (HCl-1N) vài giờ, sau đó rửa và làm khô. Photon ánh sáng ở vùng tử ngoại do đèn nguồn phát khi qua bộ tạo ánh sáng đơn sắc sẽ chỉ cho qua ánh sáng với bước sóng nhất định, và khi qua dung dịch trong cốc sẽ gây ra sự thay đổi năng lượng của các điện tử.

Khi phân tử hấp thụ năng lượng ánh sáng này, các điện tử sẽ chuyển lên mức năng lượng cao hơn. Tuy nhiên, chỉ có điện tử ở các hợp chất có nối đôi hay/và ba mới hấp thụ ánh sáng ở vùng tử ngoại. Cực đại hấp thụ (λmax) là bước sóng mà ở đó chất cho độ hấp thụ lớn nhất.

OD360: giá trị hấp thụ ở cực đại hấp thụ (λmax) M: trọng lượng phân tử chất cần phân tích. Mục đích: Pha loãng dung dịch AFG1 chuẩn, cần thiết cho những lượng mẫu rất ít sẽ dùng ở các thí nghiệm sau. Cách thực hiện: Cho 2 cóng chứa đầy dung môi CHCl3 vào quang phổ kế, sau đó lấy cóng bên ngoài ra, thay dung môi bằng dung dịch AFG1 đã pha vào đầy cóng, cho cóng vào lại quang phổ kế.

Các phân tử hấp thụ các photon ánh sáng thích hợp để chuyển từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích. Ngược lại, các phân tử đã ở trạng thái kích thích có thể trở về trạng thái cơ bản bằng cách giải phóng.  Cực đại kích thích (λEx.) là bước sóng mà khi bị kích thích tại bước sóng này, chất cho cường độ phát quang tương đối (Itđ) là lớn nhất.

Sau đó, cho tuần tự 3 ống chuẩn của máy (màu đỏ, xanh, vàng) vào để chuẩn máy. Mục đích: Khảo sát sự tương quan tuyến tính giữa lượng AFG1 và cường độ sáng trên máy huỳnh quang. Đo trên huỳnh quang kế với các nồng độ AFG1 trên (thể tích đo là 2 ml).

Hàm lượng AFG1 tối thiểu sau khi qua cột IAC được xác định bằng phương pháp huỳnh quang kế. Mục đích : khảo sát độ đồng đều của các cột IAC (khả năng bắt giữ của các cột có như nhau không).