Nghiên cứu khả năng sinh kháng sinh của các chủng nấm sợi phân lập từ Rừng ngập mặn Cần Giờ: Tìm kiếm các chất kháng sinh mới

MỤC LỤC

Phân loại nấm

Khả năng sinh kháng sinh

Nấm sợi là một trong những VSV có khả năng sinh kháng sinh được phát hiện đầu tiên nên có ý nghĩa quan trọng về mặt lịch sử lẫn y học. Từ các chủng nấm sợi Penicillium notatum, Penicillium chrysogesrum, Cephalosporium sp, Trichoderma viride…đã có hàng ngàn kháng sinh được tìm thấy sử dụng trong y học, nông nghiệp. Thực tế trong sản xuất, nhiều nước đưa vào đất các loài VSV có khả năng đối kháng với VSV gây bệnh mà không hại cây trồng.

Trong những năm gần đây, người ta phát hiện thấy nấm ở RNM có tiềm năng sinh các kháng sinh mới. Các cacbuahydro ở dạng khí (methan, ethylen và acethylen) trong điều kiện nhiệt độ và áp suất bình thường. Dầu mỏ là hỗn hợp lỏng sánh của các chất hữu cơ tích tụ thành mỏ trong vỏ trái đất, giữa các lớp đá.

Các sản phẩm thu được từ việc lọc dầu có thể kể đến xăng, dầu hoả, dầu diesel, paraphin, dầu bôi trơn nhựa đường…. Các chuỗi cacbuahydro từ C6-C12 bị trộn lẫn vào nhau được sử dụng trong đời sống với tên gọi là xăng.

Tình hình ô nhiễm dầu

Một trong những sự cố tràn dầu nghiêm trọng nhất là vụ đắm tàu chở dầu Exxon Valdez ngày 24/03/1989 làm tràn 11 triệu gallon dầu ra bờ biển bang Alaska. Tai nạn tràn dầu gần đây nhất ở phía nam bờ biển Trung Quốc vào đầu năm 2007, dầu tràn trên diện tích rộng khoảng 656 feet, dài 9 hải lí. Theo báo cáo thống kê của cục môi trường, Bộ khoa học-Công nghệ và môi trường cho biết: ừ năm 1987 đến nay đã xảy ra hơn 90 vụ tràn dầu, làm nhiều vùng biển và cửa biển bị ô nhiễm dầu.

Khoảng 200 tấn dầu được vận chuyển hàng năm ở vùng biển Việt Nam từ Trung đông đến Nhật Bản và Triều Tiên. Do va chạm vào cầu cảng tại xí nghiệp lọc dầu SaiGon Petro (Phường Thạnh Mỹ Lợi, Q.12- tp. HCM) khiến tàu bị thủng, dầu tràn ra trên đoạn đường 1km sông Đồng Nai về phía cầu phà Cát Lái. Thêm vào đó 70% nước thải từ các vùng công nghiệp khai thác dầu khí không hề được xử lí đổ ra biển.

Dầu và các sản phẩm của dầu khi tràn ra nước tạo ra lớp bao phủ trên mặt nước, ngăn cản sự trao đổi nhiệt, oxy giữa pha nước và pha khí gây ảnh hưởng đến sinh vật. Ô nhiễm dầu sẽ làm giảm hiệu quả trạng thái của đất về vi sinh vật, về động thực vật đặc biệt ảnh hưởng đến sức khoẻ con người.

Hình 1.4: Tai nạn tràn dầu ở dàn khoan [51]

Cơ chế phân giải dầu của vi sinh vật

- Oxi hoá hợp chất cacbuahydro phức tạp có khối lượng lớn thành những chất đơn giản có khối lượng nhỏ hơn để làm giảm hoặc mất độc tính tạo khí thoát ra. - Axit cacbonxylic được sinh ra có thể theo quá trình ω-oxidation rồi đến quá trình β-oxidation hoặc trực tiếp quá trình β-oxidation. Ngoài ra, sự phân giải cũng có thể đi theo con đường phụ (subterminalo- xidation), oxi hoá cacbon giữa mạch: Từ cacbuahydro sẽ tạo ra rượu bậc 2, rồi tạo xêton tạo axit béo và cuối cùng giải phóng CO2 và H2O.

Nhưng trong thực tế, thường gặp các vi sinh vật có khả năng chuyển vòng hexan thành vòng cyclo hexanol (hình 1.6) nhưng không có khả năng lacton hoá và mở mạch vòng. Sau đó, các hợp chất hữu cơ vòng thơm bị hydroxyl hoá nhờ cắt ở vị trí octo tạo ra axit muconic và bị oxi hoá tiếp thành xetoadipic. Một số loại nấm sợi thường gặp có khả năng oxi hoá các hợp chất có chứa nhân thơm như Aspergillus niger, có khả năng phân huỷ hợp chất là dẫn suất của phenol.

Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến quá trình phân giải dầu của VSV vì nó ảnh hưởng đến tính chất vật lý, hoá học của dầu cũng như khả năng sinh trưởng của VSV. Đôi khi ta thấy có những loài nấm sợi không phát triển trên môi trường chứa nguồn nitơ là muối amôn nhưng nguyên nhân không phải là do gốc NH4+ mà ở độ chua sinh lí do các muối amôn tạo ra.

Vai trò và lược sử nghiên cứu nấm sợi phân giải dầu 1. Vai trò của nấm sợi trong hệ sinh thái RNM

Ngày nay, các nhà khoa học sau khi dùng phương pháp lí-hoá để dọn bớt lượng dầu trên bề mặt đã phối hợp thêm biện pháp phân hủy sinh học để xử lí lượng dầu còn lại [27], [32]. Các công trình nghiên cứu về nấm sợi ở RNM của các tác giả trên thế giới như: Từ năm 1895 Miyoshi đã công bố công trình nghiên cứu về khả năng phân huỷ parafin trong dầu mỏ của vi sinh vật. Vi sinh vật trong môi trường có dầu mỏ, với điều kiện thích nghi chúng có thể sử dụng các thành phần cacbuahydro của dầu mỏ làm cơ chất dinh dưỡng nguồn cacbon [28].

Tuy nhiên, nó chỉ được biết đến rộng rãi như là một công nghệ cho việc làm sạch các vùng ven bờ bị ô nhiễm do sự cố tràn dầu tiêu biểu như trường hợp xử lí tai nạn tràn dầu ở Prince William Sound vào năm 1989 (Hoff, 1993). Nhưng mô tả đầu tiên về nấm biển xuất hiện trong RNM là nhà nghiên cứu nấm Cribb và Cribb (1955, 1956, 1960) ở Australia, về nhóm Philophorophoma littoralis Linder. Năm 1979 Kohlmeyer và cộng sự đẫ đưa ra danh sách 42 loài vi nấm RNM (23 loài thuộc Ascomyco-tina, 17 loài thuộc Deuterromycotyna, 2 loài thuộc basidiomycotina).

Tại Việt Nam, có công trình nghiên cứu nấm sợi có khả năng phân giải dầu thô ở các giếng khoan dầu khí thuộc tỉnh Thái Bình, Vũng Tàu của tác giả Lại Thuý Hiền. Cũng theo các nhà nghiên cứu, vi sinh vật RNM ven biển đồng bằng sông Hồng và Cần Giờ tìm thấy có khoảng 83/199 chủng nấm có khả năng phân giải dầu mỏ ở mức độ khác nhau, một số chủng nấm sợi thuộc các chi Penicillium, Aspergillus, Cladosporium, Paeci-lomyces có khả năng phân giải mạnh dầu DO.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu

Mỗi khuẩn lạc sinh ra từ một tế bào ban đầu, do đó khi tách nuôi sang môi trường mới một hoặc vài lần có thể thuần khiết được giống nấm sợi. - Nguyên tắc: Sự hiện diện của VSV có thể được định lượng bằng nhiều phương pháp khác nhau: Đếm số lượng tế bào trực tiếp trên kính hiển vi, gián tiếp thông qua mức độ cản ánh sáng (độ đục), định lượng 1 cách thống kê bằng phương pháp pha loãng tới hạn (phương pháp MPN)…. Đánh dấu vào vị trí cần cấy lên mặt đáy của đĩa MT bằng bút lông Khi cấy, úp ngược hộp MT và cấy bào tử vào các điểm đánh dấu trước, tránh sự rơi vãi bào tử trên bề mặt môi trường tại những vị trí không mong muốn.

Tốc độ phát triển của khuẩn lạc sau những thời gian nhất định (trên những môi trường xác định và ở những nhiệt độ xác định). - Nguyên tắc: Khả năng phân giải cacbuahydro được đánh giá bằng sự sinh trưởng của VSV (lượng sinh khối khô) trên MT có thành phần cacbuahydro. Đánh giá sự ảnh hưởng này thông qua việc nuôi cấy ở MT giàu chất dinh dưỡng (MT phân lập) và nghèo chất dinh dưỡng (MT khoáng).

- Yêu cầu: So sánh khả năng phân giải dầu của nấm sợi ở hai điều kiện trên trong cùng thời gian và nhiệt độ, để chọn môi trường phân giải dầu tốt nhất cho việc nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tiếp theo. Chúng tôi dùng môi trường nước biển tự nhiên không bổ sung thêm muối khoáng: Cấy 2ml bào tử nấm sợi (6,3.106CFU/ml) vào bình tam giác 250ml chứa 47,5ml nước biển và 2,5ml dầu DO và nuôi cấy tĩnh trong 15 ngày. - Yêu cầu: Đánh giá tốc độ sinh trưởng và khả năng phân giải dầu bằng cách so sánh đường kính khuẩn lạc và lượng dầu phân giải của các chủng nấm sợi trong cùng thời điểm.

- Yêu cầu: Đánh giá khả năng sử dụng các nguồn cacbon bằng mức độ phát triển của các khuẩn lạc qua độ lớn đường kính khuẩn lạc.  Dựa vào thời gian hình thành khuẩn lạc và đường kính khuẩn lạc của các chủng nấm sợi nghiên cứu để đánh giá khả năng chịu mặn của các chủng nấm sợi nghiên cứu. - Yêu cầu: Đánh giá mức độ sinh trưởng bằng cách đo đường kính khuẩn lạc, cân sinh khối nấm sợi và xác định lượng dầu phân giải.

- Yêu cầu:Đánh giá mức độ sinh trưởng của nấm sợi dựa vào độ lớn của khuẩn lạc ở mỗi lô và so sánh sinh trưởng các chủng nấm sợi khác nhau ở cùng nhiệt độ. - Cách tiến hành: Để xác định khả năng sinh enzym của nấm sợi, chúng tôi tiến hành thí nghiệm cấy chấm điểm các chủng nấm sợi trên các MT thích hợp (MT4) với cơ chất tương ứng. 10% lên bề mặt môi trường nuôi cấy, nếu nấm sợi sinh proteaza sẽ có một vòng trong suốt xung quanh khuẩn lạc, do các phân tử protein bị phân giải nên không còn phản ứng kết tủa với HgCl2.

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Khuẩn lạc của một số chủng nấm sợi phân lập từ đất RNM Cần Giờ TP. Phụ lục 2: Khuẩn lạc của một số chủng nấm sợi phân lập từ lá, thân RNM Cần Giờ.