Hoạt tính sinh học của một số thành phần cây dây lức (Ziziphus mauritiana Lam.) thu hái tại Văn Giang, Hưng Yên
MỤC LỤC
Mục tiêu nghiên cứu
Để góp phần tìm hiểu thêm giá trị mà cây dây lức đem lại và khẳng định cơ sở khoa học của các tác dụng của cây dây lức, em tiến hành thực hiện đề tài “Sàng lọc hoạt tính sinh học của cây Dây lức được thu hái tại Văn Giang, Hưng Yên”.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu nghiên cứu 1. Vật liệu nghiên cứu
1 Methanol Dùng để tạo cao chiết và đánh giá hoạt tính 2 Ethyl acetate Dùng để tạo cao chiết. 5 Ethanol Dùng để tạo cao chiết tổng ethanol 6 Pb(CH3COO)2 Dùng để định tính flavonoid 7 FeCl3. Dùng để định tính polyphenol và tannin, xác định năng lượng khử của cao chiết.
Ciocalteu Dùng để xác định hàm lượng polyphenol tổng số 12 Na2CO3 Dùng để xác định hàm lượng polyphenol tổng số 13 Gallic acid Chất chuẩn để xác định hàm lượng polyphenol tổng. 14 AlCl3 Dùng để xác định hàm lượng flavonoid 15 CH3COOK Dùng để xác định hàm lượng flavonoid. 16 Quercetin Dùng làm chất chuẩn xác định hàm lượng flavonoid 17 Ascorbic acid Dùng để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa tổng.
Dùng để pha dung dịch phản ứng đánh giá hoạt tính chống oxy hóa tổng. Dùng để pha thuốc thử ceric ammonium sulfate 19 K3[Fe(CN)6] Dùng để đánh giá năng lực khử của các cao chiết. 22 NaH2PO .2H4 2O Pha dung dịch đệm sử dụng trong đánh giá năng lực khử của cao chiết.
Đề tài được thực hiện dựa trên các thiết bị và dụng cụ thí nghiệm của Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Thủy lợi và Trung tâm Sinh học phân tử Nghĩa đô – Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các thiết bị máy móc được sử dụng STT Tên dụng cụ Model, thông số kỹ. RV- VELP, Ý Chưng cách thủy trong phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học 7 Bể siêu âm Elma S120, Đức Dùng để chiết mẫu và rửa dụng.
Đo OD các mẫu trong các quá trình đánh giá hoạt tính sinh học 10 Máy lọc nước. Thực hiện các phản ứng và bảo quản một số dung môi 13 Máy đo nhiệt độ. Kiểm soát nhiệt độ trong suốt quá trình lên men và phân tích 14 Máy lắc Vortex MX-S, Dlab, Trung.
Phương pháp nghiên cứu 1. Phương pháp tạo cao chiết
Dịch chiết của 3 lần chiết được gom lại, cô quay để loại dung môi bằng máy cất quay chân không (cất loại dung môi dưới áp suất giảm) (Model R-110, Buchi, Thụy Sỹ) và thu được cao chiết ethanol. Trongn đó, bã của cao chiết n-hexane được tiếp tục sử dụng để chiết với dung môi ethyl acetate, bã của cao chiết ethyl acetate được sử dụng để chiết với dung môi methanol. Giá trị OD được ghi nhận và tiến hành vẽ đường chuẩn để sử dụng xác định hàm lượng polyphenol tổng trong các mẫu cao chiết.
Kết quả OD được ghi nhận và tiến hành vẽ đường chuẩn để sử dụng xác định hàm lượng flavonoid trong các mẫu cao chiết. Năng lực khử (RP) được thực hiện theo phương pháp mô tả bởi Ferreira và cộng sự (2007). Hiệu quả kháng oxy hóa của các cao chiết ở các nồng độ khác nhau được so sánh với chất chuẩn bằng cách sử dụng nồng độ mà tại đó chất chuẩn hay cao chiết (àg/mL) cú giỏ trị OD = 0,5 (OD0,5).
Hoạt tính chống oxy hóa tổng của các cao chiết được thực hiện theo phương pháp phosphomolybradenum (Umamaheswari và Chatterjee, 2007). Lần lượt cho 0,1 mL mỗi dung dịch cao chiết pha loãng với nồng độ tương ứng ở trên vào ống eppendorf dung tích 2 mL, bổ sung thêm 1 mL dung dịch phản ứng (0,6 M H2SO4, 28 mM sodium phosphate và 4 mM ammolium molybdate). Ống eppendorff được đóng nắp chặt, sau đó được ủ ở nhiệt độ 95oC trong thời gian 90 phút.
Ống mẫu thí nghiệm được làm nguội tới nhiệt độ phòng, sau đó đo nồng độ hấp thụ ở bước sóng 760 nm bằng máy đo quang (BioSpectrometer Basic, Eppendorf, Đức). Gốc tự do bền DPPH được sử dụng để xác định hoạt tính ức chế gốc tự do của các mẫu cao. IC50 được định nghĩa là nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ưc chế 50% gốc tự do hoặc enzyme.
Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn: Khả năng kháng khuẩn của cao chiết được xác định dựa trên sự hình thành vòng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch nhỏ cao chiết. Dịch vi khuẩn/nấm men với mật độ 10 CFU/mL được trải đều trên bề mặt đĩa thạch Luria-6 Bertani (LB)/Hansen với thể tớch dịch vi khuẩn/nấm men là 100 àL. Tiến hành đục lỗ tạo giếng thạch và nhỏ vào mỗi giếng thạch 100 àL cao chiết ở cỏc nồng độ khỏc nhau.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Như vậy chúng ta có thể thấy, cao chiết phân đoạn methanol có hàm lượng polyphenol cao nhất, thậm chí cao hơn cao chiết tổng ethanol. Vì vậy, để tạo phân đoạn giàu polyphenol người ta có thể chiết theo cách: loại bỏ phân đoạn phân cực thấp (chiết với n-hexane), sau đó chiết với các dung môi có độ phân cực cao hơn (ethyl acetate và methanol). Trong nghiên cứu của Sudha và cs (2013), hàm lượng polyphenol có trong dịch chiết methanol của các bộ phận trên mặt đất của cây dây lức có thể đạt mức 98,31mg/g [20].
Tương tự đối với chỉ số polyphenol, hàm lượng flavonoid cũng được xác định đối với 3 cao chiết: cao chiết tổng ethanol và cao chiết phân đoạn: methanol và ethyl acetate. Hàm lượng Flavonoid có trong các cao chiết của cây Dây lức (Các ký hiệu a, b, c thể hiện sự sai số có ý nghĩa thống kê, P < 0,05, Tukey-test) Flavonoid và polyphenol được xem là hai nhóm chất có hoạt tính chống oxy hóa tốt. Flavonoid hiện được coi là một thành phần không thể thiếu trong nhiều ứng dụng dinh dưỡng, dược phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm với các đặc tính chống oxy hóa, chống viêm, chống đột biến và chống ung thư cùng với khả năng điều chỉnh chức năng enzyme quan trọng của tế bào.
Polyphenol là nhóm chất thực vật tự nhiên, các hợp chất phenolic bán hòa tan trong nước có một hoặc nhiều vòng benzen dưới dạng glycoside. Theo nhiều nghiên cứu đánh giá thuộc lĩnh vực khoa học thực phẩm, chứng minh polyphenol có nhiều lợi ích có sức khỏe và có khả năng chống lại nhiều bệnh nguy hiểm của con người. Ở giai đoạn tiếp, các cao chiết tổng và cao chiết phân đoạn được đánh giá năng lực khử, hoạt tính chống oxy hóa tổng và hoạt tính kháng vi sinh vật trong điều kiện phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học, Trường đại học Thủy lợi.
Kết quả của nghiên cứu cho thấy, cao chiết ethanol của cây dây lức có hiệu quả chống oxy hóa tốt trong ba phương pháp thử nghiệm. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả định tính, định lượng thành phần hóa học cao chiết ethanol cho thấy có chứa polyphenol và flavonoid ở trên. Kết quả nghiên cứu cho thấy, các mẫu cao chiết đều thể hiện hoạt tính chống oxy hóa, tuy hoạt tính là thấp hơn rất nhiều so với đối chứng dương là vitamin C.
Kết quả đánh giá khả năng ức chế gốc tự do DPPH của cao chiết cây Dây lức Đánh giá khả năng quét gốc tự do DPPH là phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa có tính chất căn bản, đơn giản, được sử dụng nhiều đối với các loài dược liệu. Kết quả thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH của các cao chiết từ cây dây lức cho thấy, các mẫu đều có khả năng quét gốc tự do DPPH tại các nồng độ thử nghiệm từ 10 đến 100. Trong đú phần trăm ức chế trờn 50% ở nồng độ 100 àg/mL chỉ cú ở cao chiết methanol, kết quả này cao hơn so với đối chứng dương là vitamin C.
Ngoài ra cỏc cặn chiết methanol, ethyl acetate và -n hexane cũng cho kết quả kháng chủng vi sinh vật khác như Pseudomonas putida 3326K1. Các chiết xuất thực vật có nhiều tiềm năng kháng vi sinh vật, chúng được sử dụng trong việc điều trị các bệnh do vi khuẩn kháng thuốc gây ra.
