Xác định tác nhân gây bệnh và nghiên cứu thử nghiệm một số loại thảo dược phòng trị bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng

Tình hình nghiên cứu bệnh vi khuẩn trên tôm của thế giới và Việt Nam 1. Trên thế giới

Năm 1985, các nhà khoa học, các chuyên gia về thuỷ sản bắt đầu nghiên cứu đi sâu vào lĩnh vực bệnh tôm, tuy còn non trẻ, nhưng do nhu cầu của thực tiễn, nên chỉ trong một thời gian ngắn hàng loạt công trình lớn đã được áp dụng rộng rãi vào sản xuất, đem lại hiệu quả cao. Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Việt Thắng cho thấy vi khuẩn hiện diện khá cao trên tổng số mẫu thu xét nghiệm, nhiều loại Vibrio xuất hiện với tần số lớn, 2/3 xã điều tra cho thấy hiện tượng nhiễm khuẩn (Pycnozec nhân) chiếm tỷ lệ 80-100%, điều này cho thấy các mô hình nuôi quảng canh, đặc biệt mô hình nuôi tôm sú trên ruộng. Ông đã công bố đầy đủ các khâu từ phân lập vi khuẩn, tác nhân gây bệnh, dấu hiệu bệnh lý, phân bố và lan truyền, biện pháp phòng trị với một số bệnh được đi sâu nghiên cứu như: bệnh phát sáng ở ấu trùng tôm sú, bệnh đỏ dọc thân ở ấu trùng tôm sú, bệnh hoại tử đốm nâu ở tôm càng xanh.[5].

Tình hình sử dụng hợp chất chiết xuất từ thảo dược 1. Trên thế giới

Bước đầu đã chọn được 9 loài cây thuốc sau: Rau nghể (Polygonum hydropiper), rau sam (Portulaca cleracea), cây cỏ sữa lá to (Euphorbia hirta), cỏ sữa lá nhỏ (Euphorbia thymifolis), sài đất (Wedelia calendu lacae), nhọ nồi (Eclipta alba), bồ công anh (Lactuca indica), cây vòi voi (Heliotropium indicum), cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria) có thể sử dụng trong phòng trị bệnh trên động vật thuỷ sản. Ở miền Nam, các cây cỏ được dùng trong phòng trị bệnh cho vật nuôi thuỷ sản chủ yếu từ kinh nghiệm dân gian người dân đã biết dùng cây cỏ mực (Eclipta alba), cây trầu (Piper betel) để trị bệnh kí sinh trùng cho động vật thuỷ sản, một số địa phương khác theo kinh nghiệm người dân cũng biết dùng một số loài thực vật quen thuộc để chữa bệnh cho tôm cá đem lại hiệu quả như ở Nghệ An, Huế. Chất arecolin trong hạt cau có tác dụng oxy hoá protein của tế bào kí sinh trùng làm tê liệt thần kinh của giun sán, làm tê liệt cả cơ trơn làm giun sán không bám vào thành ruột được nên dễ bị đẩy ra ngoài Dùng hạt cau với liều lượng 4g hạt cau/1kg cá/1 ngày, cho ăn trong 3 ngày để trị giun tròn kí sinh trong ruột cá trê (Spinitectus clariasi).

Nội dung nghiên cứu

Theo Đỗ Tất Lợi, trong cây có chừng 0,0049% tinh dầu và một ít chất ancaloit gọi là cocdalin. Thành phần chủ yếu của tinh dầu là metylnonylxeton, chất myrcen, axit caprinic và laurinaldehyt.

Phương pháp nghiên cứu 1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

Phương pháp phân lập xác định vi khuẩn gây bệnh dựa trên phương pháp nghiên cứu của Bergey (1957) và Nguyễn Lân Dũng (2006). Lấy mẫu bệnh phẩm: Cơ, mang, chân bơi, gan tụy của mẫu tôm được phân nhỏ, nghiền trong ống nghiệm chứa 2ml dung dịch nước muối sinh lý. Dựa vào màu sắc, hình dạng, kích thướt khuẩn lạc để phân biệt các loại khuẩn lạc có trên đĩa lồng, từ đó chọn ra khuẩn lạc nghi ngờ.

Dựa vào kết quả nuôi cấy phân lập, nhuộm vi khuẩn kết hợp với kết quả thực hiện các phản ứng sinh hóa để định danh vi khuẩn theo khoá phân lập của Bergey (1957) và Nguyễn Lân Dũng (2006). Lấy 0,1ml nước nghiên cứu ở 2 – 3 độ pha loãng khác nhau, nuôi cấy trên đĩa thạch chứa môi trường cần thiết bằng que gạt. Nuôi cấy ở nhiệt độ 300C, sau 24 giờ, đem ra đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch, lấy giá trị trung bình của các đĩa lồng có cùng nồng độ pha loãng.

Thảo dược thí nghiệm được rửa sạch, để ráo nước tự nhiên ở nhiệt độ phòng, rồi cho vào máy xay thật nhuyễn, có thể thêm một ít nước cất làm dung môi nhằm thuận tiện cho việc vắt lấy dịch chiết qua lưới lọc. Dịch chiết được bảo quản ở nơi khô thoáng với nhiệt độ luôn bảo đảm dưới 500C tránh hiện tượng tác dụng dược lý của thảo dược bị mất đi bởi nhiệt độ. Tiến hành thử nghiệm dịch chiết thảo dược trên vi khuẩn phân lập được theo phương pháp thạch lỗ của Bộ môn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội, 1998.

Phương pháp tiến hành: Lấy 0,1ml dung dịch ở ống nghiệm chứa vi khuẩn có mật độ 106CFU/ml dàn đều trên mặt thạch bằng que gạt, để khô tự nhiên.

Phương pháp xử lý số liệu

Kiểm tra trọng lượng, chiều dài mẫu bệnh phẩm đóng vai trò quan trọng trong việc chẩn đoán bệnh trên động vật thủy sản do mỗi loại tác nhân thường cảm nhiễm ở một giai đoạn nhất định của đối tượng nuôi. Tôm thẻ chân trắng dễ mẫn cảm với nhiều loại tác nhân gây bệnh khác nhau nên việc xác định giai đoạn phát triển của tôm sẽ giúp khoanh vùng được tác nhân gây bệnh để đưa ra kết quả chính xác hơn trong quá trình phân lập. Trong giai đoạn này tôm gần thu hoạch nếu bị các tác nhân gây bệnh xâm nhập sẽ gây thiệt hại nặng nề.

Theo Đỗ Thị Hòa, 2004 giai đoạn này tôm rất dễ bị cảm nhiều bởi nhiều loại tác nhân gây bệnh khác nhau do lượng thức ăn dư thừa trong ao nuôi tạo điều kiện cho các vi sinh vật gây bệnh phát triển đặc biệt đối với vi khuẩn gây bệnh.

Kết quả phân lập, định danh vi khuẩn gây bệnh

Qua các đợt thu mẫu tôm thẻ chân trắng bị bệnh, đã tiến hành phân lập, thử phản ứng sinh hoá đối với các chủng vi khuẩn phân lập được. Dựa vào kết quả thu được trong quá trình nuôi cấy phân lập kết hợp khóa phân lập của Bergey (1957) và Nguyễn Lân Dũng (2006) đã xác định được 2 chủng vi khuẩn Vibrio harveyi, Vibrio alginolyticus từ các mẫu tôm thẻ có dấu hiệu bệnh lý. Theo Bùi Quang Tề (năm 2002), các loài vi khuẩn Vibrio xuất hiện ở nhiều thủy vực mặn lợ đặc biệt trong các vùng nuôi tôm thâm canh, gây ra các bệnh chủ yếu trên tôm như: Bệnh đỏ dọc thân, bệnh ăn mòn vỏ giáp xác, bệnh mềm vỏ.

Những vi khuẩn này thường đóng vai trò tác nhân cơ hội, khi tôm sốc do môi trường biến đổi, hoặc bị nhiễm các bệnh khác như virus, nấm, kí sinh trùng. Khi sức đề kháng của động vật thuỷ sản giảm, các loài vi khuẩn vibrio này có khả năng gây bệnh nặng, gây chết hàng loạt. Vi khuẩn Vibrio harveyi thường phân bố trong nước biển, ven bờ..gây bệnh cho giáp xác, đặc biệt ở tôm nước mặn, lợ.

Theo Đỗ Thị Hòa (2004), sự khác nhau về sự khuếch tán màu sắc trên môi trường TCBS của hai chủng vi khuẩn này do khác nhau về khả năng lên men loại đường Saccarose. Trong khi đó, vi khuẩn V.harveyi không có khả năng lên men loại đường này nên không làm thay đổi màu sắc của môi trường (Hình 4.5). Kết quả phân lập không thấy sự có mặt của các loài vi khuẩn khác, điều này cho thấy hai chủng vi khuẩn phân lập được là tác nhân chính gây bệnh trên tôm thẻ chân trắng.

Lightner (1996) khi phân lập các tác nhân gây bệnh viêm ruột trên tôm sú nuôi ở Philippin, ông cũng bắt gặp các loài V.harveyi, V.alginolyticus, V.

Kết quả thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các loại thảo dược

Trong tỏi không có chất alixin ngay mà có chất aliin, một loại axit amin, chất aliin chịu tác dụng của men alinaza cũng có trong tỏi mới tạo thành alixin. Chất alixin rất dễ mất oxy do đó mất tác dụng kháng sinh, vì vậy nhiều tác giả đã cho rằng tác dụng kháng sinh của alixin chủ yếu do oxy trong phân tử. Một số tác giả khác (Lythoe và Trippet) nghiên cứu rau má đã chiết xuất được một glucozit khác đặt tên là xentelozit có tính chất gần giống như aisiaticozit.

Đối với những bệnh này, vi khuẩn dược bao phủ bởi một màng ngoài giống như sáp khiến cho hệ kháng nhiểm của cơ thể không thể tiếp cận. Đường kính vòng kháng khuẩn lớn nhất của mỗi loại thảo dược đối với các chủng vi khuẩn phân lập được sử dụng để so sánh hiệu quả giữa chúng. Trong cùng một loài vi khuẩn khả năng kháng khuẩn của thảo dược không giống nhau đối với các chủng vi khuẩn khác nhau.

Kết quả so sánh khả năng kháng khuẩn giữ các loại thảo dược khác nhau đối với các chủng vi khuẩn phân lập được. Đường kính vòng kháng khuẩn lớn nhất của mỗi loại thảo dược đối với các chủng vi khuẩn phân lập được sử dụng để so sánh hiệu quả giữa chúng. Kết quả từ đồ thị 4.5 cho thấy, đối với vi khuẩn V.alginolyticus, trong 4 loại thảo dược được thử nghiệm, tỏi có khả năng kháng khuẩn mạnh nhất với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 20,4 ± 0,82 mm.

Giữa diếp cá và rau má tuy có chênh lệch về đường kính vòng kháng khuẩn, nhưng sự chênh lệnh này không có ý nghĩa thống kê với p = 0,135. Kết quả này trái ngược với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Anh Tuấn (2008) khi thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các thảo dược trên vi khuẩn gây bệnh cá trắm cỏ, cho kết quả khả năng kháng khuẩn của hợp chất tỏi, lá húng mạnh hơn tỏi nguyên chất. Như vậy, khả năng kháng khuẩn của hợp chất tỏi, lá hung đối với các vi khuẩn gây bệnh trên đối tượng nuôi nước ngọt có thể cao hơn các vi khuẩn gây bệnh trên nước mặn.