Phân lập và đánh giá khả năng kháng nấm của xạ khuẩn Streptomyces có nguồn gốc từ đất trồng chè ở Thái Nguyên

GIỚI THIỆU VỀ XẠ KHUẨN

Trong số đó có trên 15% có nguồn gốc từ các loại xạ khuẩn hiếm như Micromonospora Actinomadura, Actinoplanes, Streptoverticillium, Streptosporangium… Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn hiếm đã cung cấp nhiều chất kháng sinh có giá trị đang dùng trong y học như gentamixin, tobramixin, vancomixin, rosamixi. Do đó một đoạn sợi (mầm xạ khuẩn) hoặc một bào tử xạ khuẩn gặp điều kiện thuận lợi sẽ trương lên, sau đó 1 - 2 giờ xuất hiện quá trình tổng hợp ARN, nhân các gene cần thiết từ genom và tiến hành tổng hợp protein, cứ như vậy sợi được hình thành và phát triển.

CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN HIỆN ĐẠI

Để phân loại xạ khuẩn đến loài, người ta sử dụng hàng loạt các đặc điểm sinh lý, sinh hóa khác như khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nitơ, nhu cầu các chất kích thích sinh trưởng, khả năng biến đổi các chất khác nhau nhờ hệ thống enzym. Nhu cầu về oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ưu, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trường, mối quan hệ với chất kìm hãm sinh trưởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với chất kháng sinh, khả năng tạo thành chất kháng sinh và các sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác của xạ khuẩn.

CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN

Để sản xuất CKS con người không chỉ tìm kiếm những chủng VSV sinh CKS từ tự nhiên mà còn cải tạo chúng bằng nhiều phương pháp như dùng kỹ thuật di truyền và công nghệ gene, gây đột biến định hướng, chọn dòng gene sinh tổng hợp, tạo và dung hợp tế bào trần để tạo ra các chủng có HTKS cao, đồng thời nhằm mục đích tìm kiếm các loại kháng sinh mới và quý trong thời gian ngắn [7],[41]. Tuy nhiên, tùy từng chủng khác nhau mà khả năng sử dụng các loại đường là khác nhau, có chủng sử dụng tốt các loại đường đơn như glucoza, mannoza, fructoza..có chủng sử dụng tốt loại đường đôi như sacaroza, maltoza..Ngoài ra một số chủng còn có thể sử dụng các loại acid hữu cơ và chất béo làm nguồn thức ăn cacbon trong lên men sinh CKS.

Phương pháp nghiên cứu

• Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn 1. Đặc điểm hình thái

Sau đó nuôi ở nhiệt độ phòng 4 - 7 ngày, từ các khuẩn lạc được làm sạch cấy truyền sang ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng Gause - I, tiếp tục nuôi ở điều kiện trên trong 10 - 14 ngày [12]. Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường ISP - 4 hoặc Gause - I trong đĩa petri sau 7 ngày dùng khoan nút chai khoan các thỏi thạch đặt vào đĩa petri đã cấy VSV kiểm định. Phương pháp khoanh giấy lọc (Xác định hoạt tính kháng sinh trong dung môi) Khoanh giấy lọc F8 có đường kính 6mm được tẩm một lượng dịch CKS (1ml/10 khoanh giấy lọc).

Căn cứ vào màu sắc HSKS của các chủng mới phân lập để phân thành các nhóm màu theo Gause và cộng sự: White (W) nhóm trắng, Gray (Gy) nhóm xám, Red (R) nhóm đỏ, Yellow (Y) nhóm vàng, Green (Gn) nhóm xanh. Màu sắc của HSCC được xác định qua quan sát trực tiếp trên môi trường thạch đĩa hoặc thạch nghiêng và mô tả theo thang màu chuẩn của Bondarsev (1953), Tresner và cộng sự (1961). Bề mặt bào tử xạ khuẩn có các dạng: Nhẵn ký hiệu là Sm (Smooth), dạng mụn cóc ký hiệu là Wa (Warty), dạng gai ký hiệu là Sp (Spiny) và dạng tóc ký hiệu là Ha (Hairy).

Thu enzym từ môi trường lỏng: xạ khuẩn sau khi được nuôi trên môi trường Gause II dịch thể sẽ được lọc bỏ sinh khối hoặc ly tâm ở 5000 vòng/ phút trong 15 phút, chiết dịch trong thì thu được enzym thô. Xác định HTKS trong dịch lên men (phương pháp đục lỗ) và sinh khối (phương pháp khoanh giấy lọc) để chọn ra môi trường cơ bản phù hợp cho những nghiên cứu tiếp theo [34]. - Nhuộm bản gel: Bản gel sau điện di được ngâm vào dung dịch thuốc nhuộm EtBr nồng độ 2 g/ml trong khoảng 10 phút, lắc nhẹ trên máy lắc, sau đó soi gel trên đèn UV và chụp ảnh bằng máy chụp gel của hãng Bio - Rad.

Phân lập và thuần khiết các chủng nấm gây bệnh trên chè

So sánh với tỷ lệ chủng xạ khuẩn kháng nấm gây bệnh đạo ôn đã công bố trước đây cùa Lê Gia Hy và cộng sự [18], tỷ lệ chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên chè của chúng tôi có phần cao hơn. Kết quả trên bảng 3.4 cho thấy: mặc dù cả 2 chủng xạ khuẩn lựa chọn đều vẫn giữ được hoạt tính kháng nấm, song mức độ kháng đối với các chủng nấm có sự khác nhau. Đối với chủng R2 màu sắc của môi trường biến đổi từ màu vàng nhạt sang màu nâu đậm, điều đó có nghĩa là chủng R2 có khả năng hình thành sắc tố melanin trên môi trường có chứa sắt.

Để đánh giá khả năng đồng hóa các nguồn cacbon khác nhau, chúng tôi tiến hành nuôi 2 chủng R2 và Đ1 trên môi trường ISP - 9 có bổ sung các nguồn cacbon khác nhau với nồng độ 1%. Kết quả trình bày trên bảng 3.8 cho thấy: cả 2 chủng đều có khả năng sử dụng nồng độ muối tới 9% , ở nồng độ muối cao hơn thi cả 2 chủng đều không phát triển được. Chúng tôi đã tiến hành kiểm tra khả năng này của 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu, kết quả được thể hiện trên hình 3.8 cho thấy cả 2 chủng xạ khuẩn đều có khả năng thủy phân mạnh casein, tinh bột và CMC.

Từ các kết quả nghiên cứu trên cho thấy 2 chủng xạ khuẩn Đ1 và R2 không chỉ có khả năng kháng nấm gây bệnh trên chè mà cũng có khả năng kháng cả các nấm gây bệnh thực vật như F. Chúng tôi nhận thấy chủng R2 có nhiều đặc điểm giống với loài này về hình thái, cuống sinh bào tử, bề mặt bào tử, đặc điểm nuôi cấy, khả năng hình thành sắc tố melanin và CKS. Đối chiếu với khóa phân loại của Gauze, 1983, chúng tôi nhận thấy chủng Đ1 có nhiều đặc điểm giống với loài Actinomyces brunneofungus về các đặc điểm hình thái, cuống sinh bào tử, khả năng hình thành sắc tố melanin và đặc điểm nuôi cấy, khả năng hình thành CKS chống nấm.

Khả năng sinh tổng hợp CKS của 2 chủng xạ khuẩn đã lựa chọn 1. Lựa chọn môi trường lên men thích hợp

Từ kết quả này đã chứng tỏ các thành phần trong môi trường lên men có ảnh hưởng nhiều đến khả năng hình thành CKS của xạ khuẩn như nhiều nghiên cứu trước đã khẳng định [14],[17]. Với mục đích là lựa chọn môi trường lên men thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp CKS, căn cứ vào kết quả này chúng tôi nhận thấy môi trường A - 4H là thích hợp nhất và được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Để nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh trưởng và hình thành CKS, đồng thời xác định được nguồn cacbon thích hợp nhất cho 2 chủng R2 và Đ1, chúng tôi tiến hành khảo sát một số nguồn cacbon thông thường được sử dụng để lên men CKS.

Kết quả trình bày trên bảng 3.13 cho thấy: cả 2 chủng xạ khuẩn R2 và Đ1 đều có khả năng sử dụng được cả 4 nguồn đường nghiên cứu. Vì vậy chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của cả 2 nguồn nitơ này đến khả năng sinh tổng hợp CKS của 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu. Nguồn nitơ hữu cơ được chúng tôi sử dụng là cao nấm men và bột đậu tương, nguồn nitơ vô cơ là nitrat kali (KNO3) và muối sunfat amon ((NH4)2SO4.).

Từ kết quả trên cho thấy cả 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu đều sinh trưởng tốt ở trong 2 môi trường có nguồn nitơ hữu cơ là bột đậu tương và cao nấm men. Các kết quả này đã khẳng định ưu thế của nguồn nitơ hữu cơ lên khả năng sinh trưởng cũng như sinh tổng hợp CKS của xạ khuẩn nói chung. Điều này có thể giải thích trong các nguồn nitơ hữu cơ, ngoài thành phần protein còn chứa các chất cần thiết cho quá trình tổng hợp CKS.

Phân loại các chủng xạ khuẩn theo phương pháp sinh học phân tử 1. Kết quả tách chiết DNA tổng số của các chủng xạ khuẩn

Cũng như sự sinh trưởng, HTKS của 2 chủng nghiên cứu cũng cao hơn ở trong 2 môi trường có bột đậu tương và cao nấm men. Kết quả nghiên cứu này của chúng tôi cũng phù hợp với một số kết quả đã công bố trước đây [14]. Kết quả tách chiết được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 0,8% và được trình bày trong hình 3.13.

Trên cơ sở kết quả thu được trong hình 3.13 cho thấy DNA đã được tách ra từ cả 2 chủng xạ khuẩn nêu trên. Tương ứng với mỗi chủng, sản phẩm điện di chỉ có một băng duy nhất đã chứng tỏ DNA không bị đứt gãy trong quá trình tách chiết. Để tạo tiền đề cho việc định loại 2 chủng xạ khuẩn đã được phân lập nêu trên, trong nghiên cứu này chúng tôi đã tiến hành khuếch đại gen 16S - rRNA.

Cặp mồi được thiết kế để khuếch đại cho phản ứng PCR cho phép khuếch đại trình tự trọn vẹn của gen 16S - rRNA, đảm bảo tốt cho các nghiên cứu tách dòng và. Mặt khác, dựa trên DNA maker chuẩn cho thấy sản phẩm PCR có kích thước khoảng 1,5 kb tương ứng với kích thước theo tính toán lý thuyết trong quá trình lựa chọn mồi. Kết quả này là cơ sở quan trọng để chúng tôi có thể tiếp tục tách dòng và xác định trình tự đầy đủ của gen 16S ở 2 chủng nghiên cứu.