Nghiên cứu hóa học các hợp chất có hoạt tính sinh học trong quả ké đầu ngựa Xanthium strumarium

Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học các hợp chất Các chất tinh khiết phân lập ra sẽ được xác định những hằng số lý hoá

- Bình nón, bình định mức, bình cầu, buret, picromet, pipet - Cột thủy tinh các cỡ có khóa để làm cột sắc ký. - Phổ khối lượng ghi trên máy MS-Engine-5989-HP ion hoá bằng va chạm electron (EI-MS) 70eV, và sử dụng ngân hàng dữ liệu DATABASE/WILLEY 250L.

Các dịch chiết

Quả Ké đầu ngựa đã sấy khô, nghiền nhỏ được ngâm chiết kiệt bằng etanol ở nhiệt độ phòng cho đến khi thu được dịch không màu. Dịch chiết được cất loại dung môi ở áp suất giảm đến dạng cao lỏng, sau đó lần lượt chiết với các loại dung môi: n-hexan, etylaxetat và metanol. Các dịch chiết nói trên được làm khan bằng Na2SO4, lọc và cất kiệt dung môi bằng cô quay dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 500 C.

- KĐN.H sản phẩm thu được từ dịch chiết quả Ké đầu ngựa bằng n-Hexan - KĐN.E sản phẩm thu được từ dịch chiết quả Ké đầu ngựa bằng EtOAc - KĐN.M sản phẩm thu được từ dịch chiết quả Ké đầu ngựa bằng MeOH. Bước1: Pha loãng mẫu thử bằng phương pháp pha loãng đa nồng độ Mẫu ban đầu có nồng độ 20mg/ml được pha loãng bằng các nồng độ khác nhau để thử hoạt tính với các chủng có từ nồng độ 128ỡg/ml; 32ỡg/ml;. Chuẩn bị dung dịch vi sinh vật hoặc nấm với nồng độ 5.105 khi tiến hành thử.

Phân lập và tinh chế các chất trong dịch chiết n-Hexan;

Để phân lập được các hợp chất trong bất kỳ một thực vật nào mà không làm ảnh hưởng tới thành phần hoá học có trong nó thì trước khi ngâm chiết bằng dung môi hữu cơ, mẫu thực vật phải được đưa đi khử men ngay sau khi thu mẫu và sấy khô ở điều kiện thích hợp. Chiết và phân lập các hợp chất từ mẫu thực vật bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần: ete dầu hoả hoặc n-hexan, cloroform, etylaxetat, metanol hoặc etanol v.v. Sau đó tách loại các hợp chất bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần như phương pháp 1 để thu được các dịch chiết có chứa các hợp chất có độ phân cực tương đối giống nhau.

Các dịch chiết thô đem thử nghiệm với các phản ứng sinh học (biotest) giúp cho việc định hướng tìm kiếm các hoạt chất trong những dịch chiết có phản ứng dương tính với các biotest. Việc nghiên cứu hoá thực vật của bất kỳ 1 loài thực vật (hay những bài thuốc dân gian) nào thường được bắt đầu bằng việc thử hoạt tính sinh học các loại dịch chiết cô của nó, nhằm định hướng cho việc phân lập các hoạt chất có trong cây. Các mẫu nghiên cứu được đem thử nghiệm với các phản ứng sinh học (biotest) và hoá học đặc hiệu sẽ cho biết chúng có những hoạt tính gì và lớp chất nào có trong thực vật.

Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của dịch chiết n-hexan, dịch chiết etylaxetat và dịch chiết metanol của quả Ké đầu ngựa được thực hiện tại phòng Thử nghiệm hoạt tính Sinh học-Viện Hoá học các hợp chất Thiên nhiên – Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định cho thấy : dịch chiết n - hexan, dịch chiết etylaxetat và dịch chiết metanol của quả Ké đầu ngựa đều cho phản ứng âm tính với các chủng vi khuẩn. Những công trình nghiên cứu trước đây về khả năng kháng khuẩn của dầu béo một số loài thực vật chi Xanthium strumarium L.cho thấy : trong dầu hạt thưc vật thuộc chi Xanthium strumarium L., có khả năng kháng khuẩn khá cao.

Theo chúng tôi, có thể các nhà nghiên cứu trước đã thu nhận dầu béo từ hạt thực vật bằng phương pháp ép trích li từ hạt, khi đó các hợp chất có chứa trong thành phần của hạt, kể cả những chất có hoạt tính và những chất không có hoạt tính, đều được ép ra cùng với dầu. Còn dầu Quả Ké đầu ngựa mà chúng tôi tiến hành nghiên cứu được tách ra từ hạt theo phương pháp chiết shoxlet trong các dung môi khác nhau (n-hexan, etylaxetat và metanol) chính vì lẽ đó mà các chất chứa trong dầu béo của quả Ké đầu ngựa được chúng tôi tách chiết ra đã có sự chọn lọc theo độ phân cực tăng dần của dung môi. Kết quả thử hoạt tính sinh học cho thấy không có dịch chiết trong các dung môi n – hexan, etylaxetat, metanol của quả Ké đầu ngựa là có khả năng kháng khuẩn yếu, như vậy chứng tỏ những chất có khả năng kháng khuẩn trong quả Ké đầu ngựa là những chất phân cực.

Nhưng trong quá trình chiết quả Ké đầu ngựa chúng tôi mới chỉ dừng lại ở dung môi metanol, nên có thể những chất có độ phân cực cao hơn và có khả năng kháng khuẩn cao chưa được tách ra.

Các axit béo

Các cấu tử chưa nhận dạng được đều là các chất có hàm lượng dưới 1%, chúng đều là những chất chưa có kết luận chắc chắn về cấu trúc phân tử. Nhìn chung các axit có số nguyên tử cacbon chẵn và nối đôi có cấu hình dạng cis hoặc Z, định vị bắt đầu từ nguyên tử cacbon số 9 kể từ nhóm cacboxyl hoặc kể từ nhóm metyl (n-9). Những chất có khung steroit được tìm thấy trong các dịch chiết của quả Ké đầu ngựa thường là các sterol C29 với bộ khung 3-ol 5-pregnan hoặc dẫn xuất của nó, trong đó mạch nhánh có cấu hình và cấu dạng khác nhau.

Dựa vào các hằng số lý hoá và đặc tính quang phổ của các chất đã phân lập được, so sánh với số liệu phổ của các chất chuẩn, đã chỉ ra những chất dưới đây. Chất rắn ở dạng vô định hình, không tan trong cloroform, metanol, dễ tan trong hệ dung môi cloroform / metanol, nóng chảy ở 273- 2750C. Các số liệu phổ thực nghiệm thu được so với số liệu phổ chuẩn đã khẳng định chất rắn vô định hình nóng chảy ở 273-2750C chính là -sitosterol-3-O--D- glucopyranosyl.

Mặt khác trên phổ EI – MS dựa vào các pic cơ bản thấy sự phân mảnh cũng phù hợp với sự phân mảnh của  - Sitosterol mà dữ liệu phổ đa ra (độ trùng lặp 83%) song pic ion phân tử và các mảnh chính đều tương đương nhau. - Trong phổ 1H – NMR cũng cho thấy vân hấp thụ dày đặc của nhiều nhóm hiđroxyl, đặc biệt trong phổ NMR cũng quan sát thấy proton “anome”. Khi đem thuỷ phân chất này bằng axit loãng đã thu được  - sitosterol đồng thời có một mảnh 396 m/z (M – C6 H12 O6), trong phổ EI – MS cũng xác nhận một phân tử hexosa đã bị loại ra khỏi phân tử sitosterol glucozit.

Mặt khác trên phổ EI – MS dựa vào các pic cơ bản thấy sự phân mảnh cũng phù hợp với sự phân mảnh của  - Sitosterol mà dữ liệu phổ đưa ra (độ trùng lặp 83%) song pic ion phân tử và các mảnh chính đều tương đương nhau. - Trong phổ 1H – NMR cũng cho thấy vân hấp thụ dày đặc của nhiều nhóm hiđroxyl, đặc biệt trong phổ NMR cũng quan sát thấy proton “anome”. Khi đem thuỷ phân chất này bằng axit loãng đã thu được  - sitostrol đồng thời có một mảnh 396 m/z (M – C6 H12 O6), trong phổ EI – MS cũng xác nhận một phân tử hexosa đã bị loại ra khỏi phân tử sitosterol glucozit.

Phổ 1H – NMR chỉ ra sự có mặt của 6 nhóm metyl dạng singlet, 2 nhóm metyl ở dạng doublet trong vùng trường cao (0,79 đến 1,07 ppm) hoàn toàn chứng tỏ đó là một tritecpen kiểu khung ursan. Lần đầu tiên quả Ké đầu ngựa (Xanthium strumarium L.) mọc hoang tại huyện Phú Lương, tỉnh Thái Nguyên được nghiên cứu sàng lọc hoá thực vật. Một số dịch chiết của quả Ké đầu ngựa được thử hoạt tính với vi sinh vật kiểm định cho thấy không có tác dụng với một số vi sinh vật kiểm định.