Phương pháp chuyển gen vào tế bào động vật có vú trong công nghệ sinh học
MỤC LỤC
Công nghệ di truyền của các tế bào động vật có vú
Với sự ra đời của kỹ thuật tế bào mầm phôi (embryo stem-ES), và sự phát triển các phương pháp giúp đạt được sự tái tổ hợp tương đồng, các nghiên cứu hiện nay có khả năng tìm hiểu về chức năng của một gen đặc biệt và xác định chắc chắn các ảnh hưởng in vitro của những biến đổi đặc biệt đến chức năng gen. Có nhiều phương pháp thích hợp để chuyển DNA ngoại lai vào trong các tế bào eukaryote, chẳng hạn như: chuyển nhiễm (hóa biến nạp) bằng calcium phostphate hoặc diethylaminoethyl-dextran (DEAE-dextran), xung điện, lipofection, liposome, viral vector (kể cả các tiểu phần phage), vi tiêm, bắn gen (vi đạn)…. Chọn phương pháp chuyển gen phụ thuộc vào mức độ biểu hiện được mong đợi, biểu hiện trong thời gian ngắn hoặc biểu hiện ổn định; loại tế bào đích, như tế bào dịch huyền phù hoặc tế bào dính bám, các dòng tế bào đã thích nghi hoặc phân hóa.
- Đặc trưng của vi tiêm là cung cấp phương thức để tạo ra các động vật được chuyển gen, đánh giá biểu hiện gen được tạo dòng trong các tế bào phôi, cung cấp phương pháp trực tiếp để tạo các đột biến thêm đoạn (insertional mutants), xác định các nhân tố điều hòa biểu hiện gen đặc trưng mô và đặc trưng tế bào, và phân lập các dòng provirus (các virus DNA được. hợp nhất trong DNA nhiễm sắc thể của tế bào vật chủ) nguyên vẹn của các retrovirus (các virus mang RNA sợi đơn được tái bản thông qua DNA sợi đôi trung gian) để tiến hành phân tích bệnh lý học. Chọn lựa một phương pháp chuyển gen thích hợp phụ thuộc vào mục đích thí nghiệm và loại tế bào đích (dính bám hay dịch huyền phù), chúng là những tế bào sơ cấp hay đã thích nghi, đã phân hóa hay có nhiều tiềm năng. Sau sự vận chuyển hiệu quả DNA vào trong nhân của tế bào nhận, biểu hiện của DNA ngoại lai tùy thuộc vào các nhân tố điều hòa: enhancer và promoter trình tự cis 5’ và các nhân tố phiên mã tác động trans (trans- acting) của tế bào vật chủ.
Cấu trúc một vector chuyển nạp gen thích hợp bao gồm các nhân tố điều hòa eukaryote và prokaryote cần thiết để thực hiện khuếch đại trong môi trường prokaryote và biểu hiện sản phẩm protein mong đợi trong vật chủ eukaryote. Các gen chỉ thị là các gen prokaryote được tạo dòng trong các vector biểu hiện ở các eukaryote cho phép thử nghiệm biểu hiện tạm thời của DNA ngoại lai nhưng không phụ thuộc vào môi trường chọn lọc. Để duy trì ổn định DNA ngoại lai đòi hỏi hoặc là DNA được hợp nhất trong nhiễm sắc thể của tế bào vật chủ hoặc là tồn tại sự bổ trợ đặc trưng giữa episome và protein tác động từ ngoài (trans-acting protein).
Sự điều hòa tiếp theo có thể bao gồm khả năng ổn định của mRNA, các tín hiệu chỉ thị (maker signals) trong vùng không dịch mã 5’ hoặc 3’ (UTR) của mRNA, các chuỗi mang bộ ba mã hóa khởi đầu tối ưu… Các hiểu biết ban đầu về cơ chế phức tạp và tinh vi của sự điều hòa gen là cơ sở để chuyển nạp gen thành công ở điều kiện in vitro và in vivo. GFP là gen duy nhất trong số các gen chỉ thị có thể phát hiện bằng kính hiển vi huỳnh quang ở các tế bào, có thể theo dừi sự sử dụng và biểu hiện của cỏc protein chỉ thị trong phõn chia tế bào ở giai đoạn tiếp theo và phân loại các tế bào biểu hiện bằng cách sử dụng thiết bị sàng lọc các tế bào có hoạt tính phát huỳnh quang. Các retrovirus vector mang GFP cho phép chuyển nhiễm dòng đã được đóng gói và sau 24 giờ các tế bào có thể được phân lập bằng thiết bị phân loại tế bào có phát huỳnh quang (fluorescence-activated cell sorter-FACS) và tiến hành nuôi cấy.
Phương pháp miễn dịch huỳnh quang kép được dùng để xác định số lượng biểu hiện của -gal như một nhân tố chỉ thị của một tế bào vi tiêm và sự có mặt hoặc vắng mặt kháng nguyên T được xem như một đơn vị đo số lượng của hiệu suất ức chế gen bởi sợi đối nghĩa ODN hoặc PNA. Thiết lập một dòng tế bào ES, các tế bào được cấy chuyển từ khối tế bào bên trong của túi phôi (blastocyt) đang phát triển lên các tầng nuôi dưỡng hoặc vào môi trường có hoạt tính ức chế phân hóa (differentiation inhibiting activity-DIA), để duy trì trạng thái không phân hóa của chúng. Việc đưa DNA ngoại lai vào trong tế bào ES có ý nghĩa hơn phương pháp vi tiêm vào phôi một tế bào nhờ ưu điểm thực tế là DNA ngoại lai có thể được thiết kế để tái tổ hợp tương đồng với bản sao nội sinh của nó (Hình 5.7b).
Nuôi cấy tế bào mầm để sản xuất cơ quan người
Bằng cách đặt gen HIV-1-tk trong vùng không tương đồng của vector đích, mọi tế bào duy trì gen này thông qua các trường hợp hợp nhất ngẫu nhiên sẽ bị giết chết trong sự hiện diện của các nucleoside nhân tạo thích hợp. Hai tính chất của tế bào ES người đa năng là khả năng sinh sản vô hạn ở trạng thái phôi nguyên thủy trong điều kiện in vitro, và khả năng phân hóa thật sự thành bất kỳ loại tế bào trưởng thành nào. Các tế bào ES cung cấp một phương tiện nghiên cứu các sự kiện chủ yếu như sự tăng sinh các tế bào đa năng, sự tham gia của chúng vào các con đường phân hóa đặc thù, cũng như các nhân tố điều khiển chúng.
Ngoài ra, tế bào ES là niềm hy vọng trong cuộc đấu tranh chống lại nhiều loại u ở trẻ em, như u nguyên bào thận, bắt nguồn từ các quần thể tế bào phôi, nhưng dấu hiệu sinh bệnh khó nghiên cứu. Những tế bào ES và con cháu phân hóa của chúng, là tiền thân của các loại tế bào nhất định, sẽ được dùng để xác định tác dụng của cytokine và các nhân tố sinh trưởng khác đến sự tăng sinh các quần thể tế bào phôi mà cho đến nay vẫn chưa tiếp cận được để nghiên cứu. Về phương diện điều trị, tương tự như các nhân tố được xác định về tác dụng kích thích sinh trưởng, các tế bào ES máu đã có ứng dụng lâm sàng trong trường hợp ghép tủy, những nhân tố sinh trưởng và phân hóa được xác định nhờ nuôi cấy tế bào ES có thể có ứng dụng trong việc tái tạo các mô khác.
Vì các tế bào ES nuôi cấy có thể dễ xử lý di truyền, nhất là chịu những biến đổi định vị tại các vị trí nhiễm sắc thể đặc thù nhờ cách tái tổ hợp cùng nguồn, mới hoặc đã biết, trong các tế bào phôi hoặc ở các tế bào trưởng thành đã phân hóa. Khả năng sản xuất với số lượng lớn một loại tế bào đặc biệt của người trong ống nghiệm, từ những tế bào tiền thân mà người ta có thể biến đổi di truyền, sẽ giúp tạo ra các mô hình bệnh lý do khuyết tật của một hoặc nhiều gen ở một mô đặc biệt. Nếu kết hợp công nghệ tế bào ES với công nghệ nhân bản động vật có vú, người ta có thể xem xét việc sản xuất tế bào ES bắt nguồn từ chính các tế bào của người bệnh, nhằm vào một loại “tự ghép”, để tránh hiện tượng thải loại.
Chỉ cần dung hợp một tế bào của người bệnh vào một noãn bào đã tách nhân (như trong trường hợp nhân bản cừu Dolly), rồi cho trứng thu được từ đó phát triển tới giai đoạn phôi bào để phân lập tế bào ES, kích thích các tế bào này phân hóa ở mô cần ghép. Chẳng hạn, người ta đã thành công khi sản xuất tế bào ES ở chuột từ một phôi bào được nhân bản, sau đó những tế bào này khi được tiêm lại vào một phôi chuột, đã phân hóa như mong đợi, thành rất nhiều loại mô. Hiện nay, hiểu biết của chúng ta về tế bào ES đa năng còn khá hạn chế, kể cả ở chuột, cho nên vẫn còn nhiều điều phải biết về tế bào ES người trước khi có thể nuôi cấy chúng với quy mô lớn và xử lý chúng về mặt di truyền.
Cuối cùng, trước khi nhân bản điều trị đạt tới giai đoạn ứng dụng lâm sàng, vẫn còn nhiều việc phải làm để cải tiến hiệu quả của giai đoạn nhân bản, và chứng minh rằng các phôi được nhân bản có thể sinh ra các mô hoạt động.
