Yếu tố ảnh hưởng đến tổng hợp xenlulaza từ vi sinh vật phân giải xenluloza

Sự phân bố của xenluloza trong tự nhiên

Sản lợng xenluloza đợc tổng hợp hàng năm trong tự nhiên lớn hơn bất kỳ chất hữu cơ nào khác. Dới dạng phế thải, xenluloza có trong các phế liệu nông nghiệp chăn nuôi, công nghiệp, đồ hộp, công nghiệp chế biến gỗ, trong chất thải sinh hoạt từ nhà bếp, đờng phố. Sự phân bố đa dạng với khối lợng lớn ở khắp nơi của xenluloza có trong rác thải là một khó khăn và trở ngại cho việc bảo vệ môi trờng, do đó để thu gom và xử lý triệt để lợng chất thải hữu cơ này đòi hỏi phải có những biện pháp và công nghệ phù hợp với từng khu vực, từng vùng.

Cấu trúc của xenluloza

-Vùng kết tinh có cấu trúc trật tự rất cao, vì thế nó rất bền vững với tác. A - Bó sợi xenluloza song song với nhau nhờ liên kết hydro B – Lát cắt bên của một sợi. Do có cấu trúc nh thế, vùng vô định hình của xenluloza có thể hấp thụ n- ớc và trơng lên.

Trong khi đó vùng kết tinh, mạng lới liên kết hydrogen ngăn cản sự trơng này. Tuy nhiên, trong dạ dày của động vật nhai lại và trong đất có tồn tại rất nhiều loại vi sinh vật có khả năng sinh sản xenlulaza, là enzym thuỷ phân xenluloza. Do đó, việc phá vỡ cấu trúc này đòi hỏi phải có sự hiểu biết sâu sắc đặc tính riêng của từng phần tạo ra chúng.

Từ đó tìm ra những biện pháp, những chủng vi sinh vật thích hợp để phân giải chúng. Bên cạnh đó,xenluloza là thành phần có số lợng và cấu tạo phức tạp hơn cả trong ligno-xenluloza. Sự tồn tại của hai vùng kết tinh và vô định hình của xenluloza cũng đòi hỏi phải có những biện pháp hoàn toàn khác nhau.

Chính vì thế, quá trình thuỷ phân xenluloza trong tự nhiên thờng diễn ra rất chậm chạp.

Enzym và cơ chế thuỷ phân xenluloza a) Enzym thuû ph©n xenluloza: xenlulaza

Xenlulaza ở vi sinh vật và cơ chế tác dụng của chúng gần đây đã đợc một số tác giả tổng kết khá chi tiết. Đây là phức hệ enzym thuỷ phân xenluloza tạo ra các đờng đủ nhỏ để đi qua vách tế bào thực vât. Theo Reese và các đồng sự thì C1 là enzym “tiền tố thuỷ phân” hay là không đặc hiệu.

Các xenluloza tự nhiên sẽ đợc chuyển thành các xenluloza hoạt động trơng nở có mạch ngắn hơn. Các chuỗi này sẽ đợc enzym Cx tiếp tục phân cắt tạo thành đờng tan (xenlobioza) và sau cùng thành glucoza[11]. Tuy nhiên Erikson và các đồng sự lại cho rằng: Đầu tiên enzym endoglucanaza tác động vào vùng vô định hình trên bề mặt xenluloza, cắt các liên kết β-1,4 glucozit và tạo ra các đầu mạch tự do.

Dựa trên kết quả trên mà Reese đã hiệu chỉnh quan niệm của mình về enzym C1 và Cx. Theo ông thì C1 có tác dụng làm trơng nở xenluloza kết tinh, phá vỡ liên kết đồng hoá trị tạo ra xenluloza biến tính. Ông cho rằng sự thuỷ phân xenluloza là kết quả của sự tác động cùng một lúc của cả.

Mặc dù có rất nhiều kết quả nghiên cứu về quá trình thuỷ phân xenluloza nhng cho đến này thì cơ chế thuỷ phân xenluloza vẫn cha hoàn toàn thồng nhất.

Enzym và cơ chế thuỷ phân lignin

Chúng chỉ xảy ra khi môi trờng thiếu các nguồn dinh dỡng cacbon dễ đồng hoá hoặc thiếu nguồn nitơ. Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy có khoảng 15 loại enzym tham gia vào quá trình thuỷ phân lignin. Ligninaza không thuỷ phân lignin thành các tiểu phần hoà tan nh phân giải xenluloza và hầu hết các polime khác, vì.

Mặt khác ligninaza lại rất khó hoà tan, chúng sẽ liên kết theo một kiểu nào đó cho phép tiếp xúc với lignin.

Nguyên vật liệu

Các điều kiện nuôi cấy có ảnh hởng tốt đến quá trình sinh tổng hợp xenlulaza của sinh vật là nitơ từ các muối nitrat. - Môi trờng 1: Để giữ giống nấm, chúng tôi sử dụng môi trờng Czapek có thành phần nh sau (g/l). - Môi trờng 2: Để phân lập và giữ giống vi sinh vật chúng tôi sử dụng môi trờng Hutchinson-Clayton có thành phần nh sau.

- Môi trờng 3: Để xác định khả năng sinh tổng hợp xenlulaza của vi khuẩn và nấm, chúng tôi tiến hành nuôi cấy trên môi trờng dịch thể có thành phần nh môi trờng 2 nhng không có Agar.

Phơng pháp nghiên cứu 1. Các phơng pháp vi sinh vật học

Để thu nhận đợc những chủng vi sinh vật có khả năng phân giải xenluloza từ mẫu rác chúng tôi sử dụng môi trờng 2. Sau đó bao gói và đặt vào tủ ấm 300C trung bình 2 ngày cho khô mặt thạch và kiểm tra mức độ vô trùng của môi trờng. Mẫu rác lấy về phòng thí nghiệm đợc nghiền nhỏ rồi pha ở các độ loãng khác nhau bằng cách lấy 1g rác đã nghiền nhỏ cho vào bình tam giác chứa 99 ml nớc vô trùng, lắc đều rồi dùng pipet hút 1 ml dịch huyền phù từ bình sang ống nghiệm chứa 9 ml nớc vô trùng.

Từ môi trờng phân lập, chọn các khuẩn lạc phát triển mạnh, mọc riêng rẽ dùng que cấy đầu tròn cấy dích dắc vào ống thạch nghiêng chứa môi trờng 2 đã vô trùng. Nuôi ở tủ ấm 300C trong 7 ngày cho vi sinh vật phát triển tốt rồi đa các ống giống vào bảo quản lạnh trong tủ lạnh 40C. Sau đó pha loãng, rồi dùng pipet vô trùng hút từ mỗi nồng độ pha loãng đó ra 0,1 ml dịch huyền phù và cấy lên các hộp petri chứa môi trờng 4 vô trùng.

Để xác định khả năng sinh tổng hợp xenlulaza ngoại bào của nấm sợi chúng tôi sử dụng phơng pháp đục lỗ trên đĩa thạch, hiện màu bằng Lugol. Phơng pháp này dựa trên nguyên tắc: Khi enzym xenlulaza thuỷ phân CMC (Cacboxymetyl Xenluloza) có trong thạch sẽ tạo thành vòng thuỷ phân màu vàng xung quanh lỗ trên nền xanh tím (do còn CMC). Dựa vào hiệu số giữa đ- ờng kính của vòng thuỷ phân và đờng kính của lỗ đục mà ta xác định đợc hoạt tính enzym xenlulaza của vi sinh vật.

Lấy ra, cho vào mỗi đĩa 5 ml dịch Lugol, tráng đều khắp mặt thạch, để trong 15 phút rồi gạn bỏ hết dịch Lugol đi.