Đánh giá khả năng phòng và chữa ung thư của hoạt chất scuterbarbalactone VN chiết xuất từ cây bách chi liên trên mô hình chuột gây ung thư thực nghiệm

Khả năng phòng và chữa bệnh ung thư

Việc chữa trị bệnh ung thư tùy thuộc từng loại ung thư, từng giai đoạn khác nhau, vào tính chất của tế bào ung thư mà áp dụng một hay nhiều phương pháp điều trị khác nhau như liệu pháp sinh học, hoá trị, xạ trị, phẫu thuật hay kết hợp cả bốn liệu pháp này. “hoá học phòng chống ung thư-Cancer chemoprevention” là việc sử dụng các hoạt chất có khả năng chống oxy hoá, kích hoạt hệ enzyme khử độc, v.v… để loại bỏ các tác nhân gây ung thư cho cơ thể hoặc sử dụng các hoạt chất có khả năng tác động tới các yếu tố truyền tín hiệu thứ cấp như NfkB (nuclear factor kappa binding), cAMP (3'-5'-cyclic adenosine monophosphate), v.v… liên quan đến quá trình phát triển ung thư để ngăn cản bệnh phát triển. • Phòng chống chữa trị ung thư ngay ở các giai đoạn phát triển ung thư Một tế bào bình thường khi chịu tác động của các tác nhân gây ung thư sẽ có sự biến đổi bất thường về mặt di truyền, các gen Proto - oncogene biến đổi thành các oncogene gây ung thư và hình thành ở giai đoạn khởi phát của bệnh ung thư.

Trong giai đoạn ung thư phát triển, việc phòng chống ung thư tập trung vào các dược chất có khả năng kìm hãm, ức chế sự phát triển, trì hoãn hay dừng sự tăng sinh của tế bào ung thư, từ đó ngăn chặn sự phát triển của khối u đã có, phòng chống sự hình thành các khối u mới sinh [35]. Hiện nay, nhiều nghiên cứu đã chứng minh rất nhiều hợp chất trong tự nhiên có hoạt tính phòng chống ung thư cao ở điều kiện in-vitro, in-vivo đã cho những kết quả khả quan khi được thử nghiệm tiền lâm sàng cũng như ở mức lâm sàng trên cơ thể người như Polyphenol của chè xanh, Piroxicam, Oltipraz Vitamin B12, Folate v.v… [4], [40]. Đỗ thị Thảo (2006), trong luận văn tiến sĩ của mình, đã phát hiện ra hoạt chất Scuterbarbalactone VN tách chiết từ cây Bán chi liên, chứng minh có khả năng ức chế và diệt tế bào ung thư phát triển ở điều kiện in-vitro nhưng không ảnh hưởng đến tế bào bình thường khác.

Quy trình tách chiết, phân lập và cấu trúc hóa học của SBVN

Đây là cơ sở để chúng tôi tiếp tục nghiên cứu sâu hơn nữa về khả năng phòng và chữa trị ung thư của hoạt chất tiềm năng này ở mức in-vivo, góp phần nhằm làm sáng tỏ vai trò của hoạt chất SBVN trong phòng ngừa và chữa trị bệnh ung thư của cây Bán chi liên. Dưới đây là quy trình tách chiết và phân lập tìm ra hoạt chất SBVN của nhóm tác giả Đỗ Thị Thảo và chúng tôi dựa trên quy trình này để tách chiết ra hoạt chất SBVN với một lượng là 8,2 gram, lượng cần thiết để phục vụ cho nghiên cứu của in vivo của chúng tôi. Các căn cứ này, kết hợp với kết quả phân tích toàn bộ các phổ NMR một chiều và hai chiều, cho phép chúng tôi tìm được cấu trúc của hợp chất SBVN là 6,11- dibenzoyloxy-8,13-epoxy-7-hydroxy-3(4)-cleroden-15,16-olide và có cấu trúc hóa học như hình 3.

Đã có một số công trình gây ung thư thực nghiệm bằng hoá chất DMBA thành công như Nicolas Currier và cộng sự đã tiến hành gây u thực nghiệm trên dòng chuột FVB/N bằng cách cho chuột uống DMBA trong 6 tuần liên tiếp, kết quả thu được rất khả quan với 100% chuột xuất hiện u ở những bộ phận khác nhau như phổi, tuyến vú, tuỷ, da. Trong đó, tế bào u báng Sarcom -180 được cấy vào xoang bụng chuột nhắt trắng dòng tế bào Swiss để xác định khả năng sinh khối u, khối lượng u báng, xác định tỷ số ức chế phát triển u, xác định tỉ lệ tế bào ung thư bị chết so với đối chứng, từ đó xác định hoạt tính ức chế sự phát triển ung thư ở điều kiện in vivo của hoạt chất cần nghiên cứu. LLC là dòng tế bào di căn và gây u mạnh, có thể gây u thực nghiệm cho chuột bằng cách tiêm tế bào LLC vào bắp đùi hoặc dưới da lưng và chuột bị tiêm ở bắp đùi sẽ có khả năng hình thành khối u cao hơn và khối u cũng phát triển nhanh, mạnh hơn so với chuột bị tiêm dưới da lưng.

Phương pháp nuôi cấy tế bào in-vitro

- Tủ cấy vô trùng Safety Laminar Level II Microflow (Anh) - Tủ nuôi tế bào National (Nhật Bản). - Máy khuấy từ nhiệt (Đức), thiết bị làm khô tuyệt đối và các dụng cụ thí nghiệm thông thường khác như kim uống, kim tiêm, dao, kéo, thước, compa; bình nitơ lỏng bảo quản tế bào, tủ sấy vô trùng, nồi hấp diệt trùng…. - Chuyển tế bào sang ống li tâm quay với tốc độ 300 vòng/phút trong 5 phút.

- Chuyển tế bào sang chai nuôi, nhỏ từ từ từng giọt môi trường nuôi cấy thích hợp vào chai nuôi để tế bào bám thành một lớp dưới đáy chai nuôi. Tế bào mới đánh thức rất nhạy cảm, dễ bị chết nếu đưa vào môi trường mới quá nhanh.

Phương pháp gây ung thư thực nghiệm trên chuột dòng BALB/c

Các khối u được tách ra và cân trọng lượng, kiểm tra khả năng di căn đến các cơ quan nội tạng. U ở phổi sẽ được phát hiện bằng cách bơm 01ml India Pink (nồng độ 5%) vào phổi qua đường khí quản sau đó tách phổi và đểm khối lượng u không bắt mầu xanh trên bề mặt phổi.

Phương pháp thử độc tính bán trường diễn

• Nghiên cứu ảnh hưởng của hoạt chất đối với chỉ tiêu huyết học máu của chuột khi cho uống bán trường diễn. Trước khi thí nghiệm 2 ngày và sau khi kết thúc thí nghiệm 30 ngày theo dỏi, mỗi lô chọn ra 1 con lấy máu để xác định: Số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, lượng Hemoglobin, creatin và xác định hoạt độ của các enzyme transamiase (SGOT, SGPT) để đánh giá chức năng thận, gan theo phương pháp của Bermeyer (1974). • Nghiên cứu ảnh hưởng của hoạt chất khi cho uống bán trường diễn đến sự tăng trọng lượng cơ thể của chuột.

Số lô thí nghiệm và mức liều dùng được bố trí tương tự như ở thi nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của hoạt chất đối với chỉ tiêu huyết học máu khi cho uống bán trường diễn. Sáu ngày cân trọng lượng chuột một lần, để đánh giá khả năng tăng trọng lượng cơ thể chuột theo phương pháp của Abrham (1978). • Nghiên cứu ảnh hưởng của SBVN khi cho uống bán trường diễn đối với các biến đổi giải phẫu ở gan, thận, chuột thí nghiệm.

Phương pháp xác định khả năng phòng và chữa ung thư của SBVN trên chuột được u thực nghiệm

- Lô 9: (đối chứng dương): chỉ tiêm tế bào LLC và cho uống dung dịch sinh lý là dung môi được sử dụng để pha SBVN trong suốt thời gian thực hiện thí nghiệm. Như vậy, với thiết kế thí nghiệm như trên, chúng tôi sẽ kiểm tra được khả năng bảo vệ cơ thể của SBVN trước khi gây u bằng tế bào ung thư LLC ở các liều lượng khác nhau (lô 1, 2). Theo dừi chuột hàng ngày, cõn khối lượng hàng tuần theo phương phỏp của Abrham (1978), đo kích thước khối u tại vị trí tiêm theo phương pháp của Ligo và.

Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh cây Bán chi Liên có hoạt tính rất tốt trong kìm hãm hoặc ức chế tế bào ung thư phát triển. Hoạt tính của loài thực vật này không mang tính độc tế bào đối với các tế bào thường mà chỉ tác động mạnh tới các tế bào ung thư. Trong báo cáo của các nhà khoa học gần đây về hoạt tính chống ung thư từ cây Bán chi Liên đã chỉ ra rằng hoạt chất chống ung thư của loài thực vật này chính là khả năng tác động, dẫn dắt tế bào ung thư tới quá trình tự chết [63].

Kết quả gây u cho chuột thực nghiệm bằng hoá chất DMBA

Còn trong nghiên cứu của chung tôi hoạt chấtSBVN được nghiên cứu sâu hơn ở mức độ in-vivo trên chuột bị gây u thực nghiệm. Tốc độ tăng trọng của chuột thí nghiệm (gram) và tỉ lệ chuột sống/chết ở từng lô thí nghiệm (n = 10 chuột) khi gây u bằng hóa chất DMBA. Như vậy, có thể thấy rằng việc sử dụng DMBA để gây u có ảnh hưởng rất nhiều tới mức độ tăng trọng và tỉ lệ sống sót của chuột thí nghiệm.

Phương pháp gây u thực nghiệm bằng DMBA sẽ cho hiệu quả cao nhất khi chuột được uống DMBA với liều 1 mg/con/lần/tuần (88,9%) và ở liều này tỉ lệ chuột chết trong quá trình gây u thấp. Bên cạnh các khối u tuyến vú, trong cơ thể chuột thí nghiệm còn xuất hiện nhiều loại u nội tạng khác như u phổi, gan. Như vậy, dùng DMBA gây u tuyến vú nói riêng và u thực nghiệm nói chung cho chuột là mô hình hoàn toàn phù hợp để thử nghiệm in vivo các hoạt chất phòng chống ung thư tiềm năng (bảng 4).

Kết quả gây u cho chuột thực nghiệm bằng tế bào ung thư LLC nuôi cấy in-vitro

Ghi chú: Chỉ số Ts: Số chuột có u/ số chuột sống sót Chỉ số Tc: Tổng số khối u các loại. Chỉ số Tv: Thể tích trung bình khối u tuyến vú (mm3) Hệ số Tb: Hệ số trung bình số lượng khối u/1 chuột.