NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA AZOSPIRILLUM TRONG SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA CÂY LÚA BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU I. Giới thiệu về cây lúa

• Vai trò của Azospirillum trong nông nghiệp
• Một số kỹ thuật trong sinh học phân tử

Nắm được qui luật sinh trưởng, phát triển của cây lúa, chúng ta có thể chủ động áp dụng các biện pháp kỹ thuật theo hướng có lợi nhất cho quá trình sinh trưởng và phát triển nhằm tạo năng suất cao. Các số liệu trên cho thấy cần đánh giá lại một cách nghiêm túc vai trò của lúa gạo cả nước nói chung và Đồng Bằng Sông Cửu Long nói riêng để đảm bảo vững chắc an ninh lương thực quốc gia và ổn định lượng gạo xuất khẩu. Theo Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn (2004) cây thiếu đạm thường sinh trưởng kém, diệp lục tố khó thành lập nên lá thường bị vàng úa, cây còi cọc, lùn, năng suất kém; số lá, số chồi, số nhánh ít, kích thước lá nhỏ.

Trong cây lúa, đạm tập trung nhiều ở phiến lá hơn là các cơ quan khác và cũng là nguồn protein chủ yếu cho sự hình thành hạt, chính vì vậy đạm mang lại hiệu quả cao trong thực tế sản xuất rừ hơn cỏc yếu tố khoỏng khỏc. NH3 + Acid hữu cơ Acid amino Protein Chính vì vậy mà vai trò của sự cố đinh đạm sinh học có một ý nghĩa hết sức quan trọng đối với nông nghiệp, nhất là đối với các nước có nền công nghiệp sản xuất phân hóa học chưa phát triển mà Việt Nam là một ví dụ điển hình. Trong tương lai, khả năng cố định đạm trong cây không phải họ đậu có thể làm giảm và thậm chí là loại bỏ hẳn sự cần thiết sử dụng phân bón vô cơ trong nông nghiệp, đồng thời cũng có thể cải thiện được năng suất của mùa màng khi sự cộng sinh cung cấp nguồn đạm liên tục cho cây trồng (http://www.vinachem.

Vi khuẩn Azospirillum có khả năng cố định đạm tự do hoặc kết hợp với vùng rễ của cây họ hòa bản, đặc biệt vùng rễ của cây cỏ nhiệt đới , lúa nước, mía, ngô, lúa mì (Boddy và ctv, 1995). Azospirillum có thể tiết ra những kích thích tố tăng trưởng thực vật như IAA (Indole - 3 - acetic acid), IBA (Indole - 3 - butyric acid), ABA (Abscisic acid) và Cytokynin (Bashan và Levanony, 1990). Sự sản xuất hormone thực vật của vi khuẩn Azospirillum đã làm tăng chiều dài rễ, tăng hấp thu khoáng, từ đó giúp tăng khả năng sinh trưởng của cây (Okon và Kapulnik, 1986), giúp cây chống chịu khô hạn.

Để phát hiện loài vi khuẩn Azospirillum lipoferum, người ta dùng cặp mồi chuyên biệt dựa trên trình tự gen nifH của vi khuẩn Azospirillum được công bố trên website ngân hàng gen để nhận diện chúng (http://www.ncbi.nlm. Theo dữ liệu của thế giới ở thập kỷ qua, khi ủ thử nghiệm hột giống với Azospirillum hoặc kết hợp với vi khuẩn cố định đạm khác dẫn đến kết quả là vi khuẩn có khả năng gia tăng sản lượng nông nghiệp trên những loại đất và khu vực khác nhau (Sumner và ctv, 1990; Fages và ctv, 1994). Điều này được giải thích như sau: khi ủ hạt giống với vi khuẩn với Azospirillum không chỉ giúp cố định đạm trong vùng rễ mà còn làm cho hệ thống rễ phát triển nhiều hơn, gia tăng diện tích tiếp xúc của rễ với đất nhờ đó mang lại hiệu quả cao trong sự thẩm thấu nước và chất dinh dưỡng, giúp tăng năng suất cây trồng (Bashan và Holguin, 1997; Boddey và ctv, 1986).

Tại Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Việt Nam, ở bộ môn Vi sinh vật học, thí nghiệm về xử lý mầm mạ với chế phẩm Azospirillum cho thấy mạ cứng chắc và lớn hơn, chống chịu rét tốt hơn nếu mạ gặp rét đậm kéo dài (dưới 100C). Riêng Đào Thanh Hoàng (2005) đã phân lập được 28 dòng vi khuẩn cố định đạm từ lúa trồng, lúa hoang hay cỏ dại và đã xác định 3 dòng A16, A28 và A31 là Azospirillum lipoferum có nguồn gốc từ thân, rễ lúa trồng (lúa cao sản) và lúa hoang. Các kết quả thí nghiệm trên cho thấy loài Azospirillum lipoferum phân bố rộng và chúng có những đóng góp lớn trong việc tăng năng suất cây trồng, thay thế phần nào lượng phân hóa học bón cho cây, cải tạo đất đai và giảm thiểu ô nhiễm môi trường.

PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP I. Địa điểm và thời gian

• Phương tiện
• Hóa chất

(Cặp mồi chuyên biệt để nhận diện Azospirillum lipoferum được Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Cần Thơ thiết kế dựa theo trình tự gen nifH của vi khuẩn Azospirillum được công bố trên website htpp://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html). Sau đó cho vào bao nylon và được mang về phòng thí nghiệm vi sinh vật để tiến hành xử lý mẫu và phân lập vi khuẩn Azospirillum. - Mẫu được giã nhuyễn trong cối, sau đó cho 1ml nước cất vô trùng vào mẫu và trộn đều.

- Hơ nóng kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn, chấm đầu kim cấy vào ống lấy vi khuẩn từ vòng pellicle cấy lên đĩa petri có môi trường NFb đặc theo đường zigzag hay chữ chi và ủ trong tủ ủ ở 310 C. - Sau 2 - 3 ngày, chọn những khuẩn lạc rời, nhỏ, tròn và phải nằm trên đường cấy tiến hành cấy chuyển. - Sau vài lần cấy chuyển, chọn lọc những khuẩn lạc rời trên môi trường đĩa, trữ lại trên môi trường ống NFb như là một dòng, sau đó kiểm tra các dòng vi khuẩn này dưới kính hiển vi để xem ròng hay không.

- Dùng đầu kim cấy lấy một ít vi sinh vật rồi chấm vào giọt nước cất trên kính mang vật (trong điều kiện vô trùng). - Lấy kính đậy vật đậy lên giọt nước cất bằng cách để một cạnh của kính đậy vật tiếp xúc với kính mang vật 1 góc 450, rồi hạ kính đậy vật xuống từ từ sao cho không có bọt khí trong mẫu vật. - Quan sát dưới kính hiển vi để thấy chuyển động. Phương pháp nhuộm được tiến hành theo các bước sau a). - Áp dụng thủ thuật vô trùng lấy một ít vi sinh vật cho vào giọt nước, trải ra cho đều và thật mỏng theo hình xoắn ốc. - Lướt mặt dưới của kính mang vật trên ngọn lửa đèn cồn cách khoảng 10cm từ độ 3 lần để giết chết vi sinh vật và dán chúng lên kính mang vật.

- Rửa cồn + aceton thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối phiến kính, rửa đến khi giọt cồn + aceton không còn màu tím nữa. Quan sát hình dạng và đo kích thước tế bào vi khuẩn Azospirillum dưới kính hiển vi ở vật kính X40. - Thước trắc vi thị kính là một miếng kính hình tròn có khắc 100 vạch giữa 2 thấu kính của thị kính.

- Thước trắc vi vật kính được đặt trên một miếng kính đặc biệt dài 2mm chia thành 200 khoảng. - Xê dịch thước trắc vi vật kính và xoay thước trắc vi thị kính sao cho 2 thước song song và gần sát nhau, tiếp tục xê dịch thước trắc vi vật kính thế nào. Di chuyển vi mẫu thế nào cho một đầu của mẫu đo trùng với 1 vạch của thước trắc vi thị kính, từ đó tìm 1 vạch thứ 2 trùng với đầu kia của mẫu đo.

Suy ra kích thước vi mẫu bằng cách lấy số khoảng trùng nhân với trị số 1 khoảng cách của thước trắc vi thị kính. Kiểm tra các dòng vi khuẩn Azospirillum đã phân lập bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction).