Nghiên cứu khả năng phân giải cellulose của các chủng nấm mốc phân lập từ môi trường tự nhiên ở Thừa Thiên Huế

Các nhóm vi sinh vật phân giải cellulose

Ngày nay, nhiều nước đã sản xuất chế phẩm cellulase vi sinh vật trong công nghiệp ở qui mô lớn và đã ứng dụng cellulase trong nhiều lĩnh vực. Các vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose mạnh trong dạ cỏ là: Ruminococcus albus, Ruminococcus flavefaciens, Ruminococcus parum, Bacteroides amylophilus, Bacteroides succinogenes, Clostridium butyricum, Clostridium cellobronarum. Các vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose khá mạnh như: Pseudomonas fluorescens var cellulose, Acetobacter xylinum, Cellvibrio gilvus, Cellvibrio fulvus… Nhiều loài nấm có khả năng tổng hợp cellulase có hoạt tính khá cao như: Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus, Aspergillus amstelodamy, Aspergillus fumigatus; Mucor pusillus; Penicillium notatum, Penicillium variabite, Penicillium pusillum; Trichoderma koningi, Trichoderma lignorum, Trichoderma viride… Người ta thấy các nấm mốc thường sản sinh enzyme cellulase với nồng độ cao hơn là vi khuẩn.

Giới thiệu về nấm Trichoderma

- Nấm ký sinh: Trichoderma có khả năng khống chế, cạnh tranh và tiêu diệt nhiều loại nấm gây bệnh thối rễ, chết rạp cây con, xì mủ…trên cây trồng như Pythium, Rhizoctonia, Fusarium, Phytophthora, Sclerotium… bằng cách tiết ra một enzym làm tan vách tế bào của các loại nấm gây hại, sau đó Trichoderma xâm nhập và hút dinh dưỡng của các loại nấm hại làm các loại nấm gây hại bị chết. - Phân hữu cơ sinh học: Nhờ các đặc tính trên mà thường được trộn chung với các loại phân hữu cơ (phân chuồng) và các chế phẩm sinh học…bón vào đất để hạn chế bệnh hại và cải tạo tính chất vật lý, hóa học của đất giúp đát tơi xốp, thoáng khí, nhiều chất mùn, tăng độ phì, tạo điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật có ích và vi sinh vật đối kháng phát triển, hạn chế phân bón hóa học và thuốc BVTV, giúp tăng cường khả năng phát triển, phục hồi bộ rễ. Phân bón vi sinh vật phân giải cenlulose là sản phẩm chứa một hay nhiều chủng vi sinh vật sống, đã được tuyển chọn với mật độ đạt theo tiêu chuẩn hiện hành có khả năng phân giải cenlulose , để cung cấp chất dinh dưỡng cho đất và cây trồng, tạo điều kiện nâng cao năng xuất và chất lượng nông sản, tăng độ màu mỡ của đất.

Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Các chủng nấm mốc được phân lập từ các bãi rác, xưởng mùn cưa, rơm rạ mục, lá cây mục và một số vùng đất canh tác khác nhau ở Thừa Thiên Huế.

Thiết bị, dụng cụ và môi trường thí nghiệm 1.Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm

* Môi trường thử hoạt tính phân giải cellulose của các chủng nấm mốc Sử dụng môi trường Czapek- dox nhưng thay nguồn carbon bằng CMC (carboxyl methyl cellulose) để đánh giá hoạt tính phân giải cellulose của các chủng nấm mốc. Để nuôi cấy thu dịch chiết enzyme cellulase ngoại bào chúng tôi sử dụng cả hai loại môi trường lỏng và xốp. Môi trường lỏng có thành phần tương tự môi trường Czapek- dox nhưng không có thạch agar và thay đường saccarose bằng CMC (carboxyl methyl cellulose).

Nội dung và phương pháp nghiên cứu 1. Nội dung nghiên cứu

Để làm môi trường thạch nghiêng, rót khoảng 3- 4 ml môi trường (chưa thanh trùng) vào mỗi ống nghiệm, đậy nút bông, đem hấp thanh trùng, như trên, sau đó lấy ra và đặt nghiêng ống nghiệm để tạo mặt thạch nghiêng. Trên môi trường Czapeck-dox thay nguồn carbon là CMC, nấm mốc có hoạt tính phân giải cellulose sẽ tiết ra enzyme cellulase nhằm phân hủy cơ chất CMC để sinh trưởng, phát triển vì vậy sẽ làm cho môi trường xung quanh khuẩn lạc trong hơn khi nhuộm bằng thuốc nhuộm Congo Red. Đem nhuộm khuẩn lạc nấm mốc với thuốc nhuộm Congo Red (1g/lít) trong 15 phút, chuyển sang rửa với dung dịch nước muối NaCl 1M, sau đó đo đường kính vạch phân giải (vạch trong suốt đo từ mép khuẩn lạc).

Tiến hành nuôi cấy lắc các chủng nấm mốc tuyển chọn trong môi trường dịch thể ở 120 vòng/phút trong 5 ngày, ly tâm dịch nuôi cấy ở 5000 vòng trong 20 phỳt, thu dịch chiết enzyme. Tiến hành nuôi cấy các chủng nấm mốc tuyển chọn trên môi trường xốp gồm cám gao: bột bắp với tỉ lệ 3:1, có bổ sung 10ml dung dịch Czapek –dox, nuôi cấy tĩnh trong vòng 5 ngày ở 30OC. Để thăm dò thời gian thích hợp cho việc sinh tổng hợp enzyme cellulase của chủng nấm mốc tuyển chọn, chúng tôi sử dụng môi trường xốp cám gao:bột bắp với tỉ lệ 3:1 để nuôi cấy.

Để thăm dò nguồn carbon thích hợp cho việc sinh tổng hợp enzyme cellulase của chủng nấm mốc tuyển chọn, chúng tôi nuôi cấy chủng nấm mốc tuyển chọn trên các loại môi trường xốp khác nhau gồm cám gạo: bột bắp (tỉ lệ 3:1); cám gạo: trấu (tỉ lệ 3:1); cám gạo; trấu; rơm rạ; vỏ lạc. Sau đó tách chiết và đánh giá hoạt độ của enzyme cellulase thô ở các loại môi trường khác nhau bằng phương pháp khuếch tán trên thạch đĩa (như trình bày ở phần 3.4.2.4). Trong môi trường tự nhiên không thể kiểm soát được các điều kiện tối ưu thích hợp với quá trình ủ phân như trong phòng thí nghiệm nên ta tiến hành ủ phân ngoài trời ở nhiệt độ thường để xem xét khả năng xử lý phế thải sau trồng nấm của các chủng nấm mốc để tạo phân hữu cơ sinh học.

Sau khi ủ khoảng 4 tuần, so sánh sự giảm hàm lượng cellulose trong sản phẩm ủ có bổ sung vi sinh vật so với mẫu đối chứng để đánh giá được hiệu quả phân giải cellulose của vi sinh vật đối với việc phân giải rơm rạ sau trồng nấm.

Xử lý số liệu

Thông thường, ở các vùng đất có canh tác, giàu mùn và rác mục, số lượng nấm mốc phân giải cellulose nhiều hơn hẳn các mẫu đất bạc màu, đất trống nghèo mùn, nghèo dinh dưỡng. Nhìn chung các mẫu đất có số lượng khuẩn lạc nấm mốc lớn, nguyên nhân do khả năng sinh trưởng phát triển của nấm mốc mạnh, phân bố rộng khắp, các mẫu đất thu thập được lựa chọn những nơi nhiều dinh dưỡng, có khả năng chứa nhiều nấm mốc nhất. Trên môi trường CMC, nấm mốc có hoạt tính phân giải cellulose sẽ tiết ra enzyme cellulose nhằm phân hủy cơ chất CMC để sinh trưởng, phát triển vì vậy sẽ làm cho môi trường xung quanh khuẩn lạc trong hơn khi nhuộm bằng thuốc nhuộm Congo Red.

Qua kết quả ở bảng 4.2 cho thấy: khả năng sinh tổng hợp cellulose ở các chủng nấm mốc ở các mẫu thu thập được là rất đa dạng, mức độ phân giải của các chủng nấm mốc khác nhau. Trong số 62 chủng nấm mốc đã sơ tuyển, chúng tôi chọn hai chủng nấm mốc 6NH1 và 16XC2 có mức độ phân giải cellulose mạnh đem nuôi lắc 120 vòng/phút trên môi trường dịch thể Czapek- dox với nguồn cơ chất là CMC và nuôi cấy hai chủng nấm mốc trong môi trường xốp. Ghi chú: D: vòng phân giải ngoài, d: đường kính khuẩn lạc Bằng phương pháp khuếch tán cho thấy hoạt độ enzyme cellulase của hai chủng nấm mốc nuôi cấy trên môi trường dịch thể yếu hơn so với trên môi trường xốp.

Ghi chú: D: vòng phân giải ngoài, d: đường kính khuẩn lạc Từ kết quả trên bảng 4.4 chúng tôi nhận thấy mỗi chủng nấm mốc đều có đặc điểm sinh trưởng riêng biệt, nhưng cả hai chủng nấm mốc đều có hoạt tính cellulose thay đổi theo thời gian. Nguyên nhân của hiện tượng hoạt tính giảm dần có thể do môi trường cạn dần nguồn cơ chất, hoặc do trong quá trình trao đổi chất, nấm mốc đã tích lũy nhiều sản phẩm trung gian kìm hãm quá trình sinh tổng hợp cellulase. Qua kết quả nghiên cứu về thời gian sinh trưởng đến hoạt tính cellulase của 2 chủng nấm mốc được chọn lọc, chúng tôi tiếp tục chọn lọc được chủng 6NH1 để tiếp tục các nghiên cứu khác.

Nguyên tắc phương pháp này dựa vào phản ứng màu của nhóm C=O với 3, 5-dinitrosalicilic acid (DNS), giá trị mật độ quang đo được ở bước sóng 540 nm phản ánh lượng đường được tạo thành từ quá trình phân cắt phân tử cellulose thành đường khử của enzyme cellulase. Sau khi tìm hiểu về các yếu tố thời gian, nguồn carbon, chúng tôi tiến hành thử nghiệm khả năng phân giải lục bình của chủng nấm mốc 6NH1 và chủng 16XC2 ở điều kiện phòng thí nghiệm, trong vòng 30 ngày. Tỉ lệ này nhìn chung còn thấp nguyên nhân là do sự tích nước trong các mẫu lục bình của công thức II và III sau xử lý rất cao, nên chưa phản ánh hết khả năng phân giải chất xơ của các chủng vi sinh thí nghiệm.

Thử nghiệm khả năng xử lý phế thải rơm rạ sau trồng nấm của chủng vi khuẩn ngoài đồng ruộng nhằm tạo phân hữu cơ sinh học

Thử nghiệm khả năng xử lý phế thải rơm rạ sau trồng nấm của chủng.