Phân lập và lựa chọn chủng vi khuẩn để chế tạo vắc-xin phòng bệnh viêm phổi do vi khuẩn gây ra

Kết quả kiểm tra một số ủặc tớnh sinh húa của 10 chủng A.pleuropneumoniae phõn lập ủược

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 38. Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 39.

Kết quả giỏm ủịnh một số ủặc tớnh sinh húa của cỏc chủng P.multocida phõn lập ủược

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 40. - Cả 10 chủng P.multocida kiểm tra ủều bắt màu gram õm, kớch thước nhỏ, dạng cầu trực khuẩn hoặc hỡnh trứng. Cỏc chủng ủều mọc tốt trờn mụi trường thạch mỏu nhưng khụng gõy dung huyết và ủều khụng mọc trờn mụi trường MacConkey.

- Tất cả cỏc chủng ủều lờn men cỏc loại ủường: Glucose, Galactose, Mannitol, Saccharose, Fructose và không lên men Lactose, Maltose, Arabinose. - Cỏc kết quả kiểm tra này ủều phự hợp với mụ tả của Carter (1967) về ủặc tính sinh học của vi khuẩn P.multocida.

Kết quả kiểm tra một số ủặc tớnh sinh húa của cỏc chủng vi khuẩn Streptococcus suis phõn lập ủược

Còn với các chủng vi khuẩn P.multocida, chúng tôi sử dụng phản ứng Multiplex - PCR ủể xỏc ủịnh cỏc typ giỏp mụ A, B, D của cỏc chủng P.multocida phõn lập ủược theo quy trỡnh ủó ủược chuẩn húa của Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y (ðỗ Ngọc Thúy và cs, 2007). Như vậy, cỏc chủng A.pleuropneumoniae mà chỳng tụi phõn lập ủược ủều thuộc serovar 2 và 5, kết quả này cú thể thấy vai trũ gõy bệnh viờm phổi của lợn của A.pleuropneumoniae tại nước ta thuộc serovar 2 và 5, ủặc biệt là serovar 2. Cỏc cặp mồi mà chỳng tụi sử dụng cho phản ứng PCR ủịnh typ giỏp mụ vi khuẩn P.multocida là: CAPA-F và CAPA-R dựng ủể xỏc ủịnh typ A cho kớch cỡ sản phẩm là 1044bp, CAPB-F và CAPD-F và CAPD-R ủể xỏc ủịnh typ D cho sản phẩm là 657bp.

Chỳng tụi ủó tiến hành xỏc ủịnh serotyp của vi khuẩn Pasteurella multocida phõn lập ủược, kết quả ủược trỡnh bày ở bảng 4.4 cho thấy: trong số 10 chủng Pasteurella multocida phõn lập ủược chọn cú 6 chủng thuộc serotyp A, chiếm tỷ lệ 60.0%, có 4 chủng thuộc serotyp D, chiếm tỷ lệ 40,0%. Như vậy, cỏc chủng Pasteurella multocida mà chỳng tụi phõn lập ủược chọn ủều thuộc serotyp A và D, kết quả này cú thể thấy vai trũ gõy bệnh viờm phổi của lợn của Pasteurella multocida tại nước ta thuộc serotyp A và D, ủặc biệt là serotyp A.

Kết quả kiểm tra ủộc lực của vi khuẩn P.multocida phõn lập ủược Chỳng tụi tiến hành xỏc ủịnh ủộc lực của cỏc chủng vi khuẩn

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 46. Vi khuẩn S.suis serotyp 2 cũng ủó ủược phõn lập từ lợn khỏe mạnh bình thường nhưng với tỷ lệ thấp (Clifton-Hadley và cộng sự, 1984). Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 47.

Tiến hành phõn lập lại vi khuẩn P.multocida từ mỏu tim của những chuột chết ủều cho kết quả dương tớnh. Từ kết quả này cho thấy phần lớn các chủng vi khuẩn P.multocida mà chỳng tụi phõn lập ủược cú ủộc lực mạnh, do ủú cú khả năng gõy bệnh cho lợn khi gặp ủiều kiện thuận lợi nào ủú tỏc ủộng.

Kết quả kiểm tra ủộc lực của vi khuẩn A.pleuropneumoniae phõn lập ủược

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 48.

Kết quả kiểm tra ủộc lực của một số chủng vi khuẩn Streptococcus suis phõn lập ủược

Như vậy, có thể thấy: các chủng thuộc serotyp 2, 7 và serotyp 9: chiếm ưu thế trong số cỏc chủng vi khuẩn phõn lập ủược từ cỏc lợn cú triệu chứng lõm sàng là những chủng cú ủộc lực mạnh hơn hẳn, cú thể gõy chết chuột trong thời gian ngắn. Roberts và cộng sự (1968) ủó thử ủộc lực của cỏc chủng vi khuẩn Streptococcus phõn lập ủược bằng cỏch tiờm tĩnh mạch cho chuột bạch, sau 24 - 48 giờ ủó gõy nhiễm trựng huyết, con vật ủ rũ, bỏ ăn và chết. Jones (1981) khi tiêm vi khuẩn Streptococcus vào tĩnh mạch chuột bạch, sau 24 - 48 giờ thấy chuột chết và ủó phõn lập ủược vi khuẩn gõy nhiễm ban ủầu từ mỏu tim, cũn những chuột khụng chết ủều cú triệu chứng thần kinh.

Chỳng tụi ủó tiến hành xỏc ủịnh liều LD50 của vi khuẩn Streptococcus phõn lập ủược và ủó xỏc ủịnh ủược liều LD50 của Streptococcus typ 2 là: LD50. Do A.pleuropneumoniae phát triển không tốt trên các môi trường nuôi cấy thông thường, nên thường phải tiến hành nuôi cấy trong môi trường giàu dinh dưỡng và nuôi cấy trong tủ ấm 5-10% CO2.

Kết quả kiểm tra ủậm ủộ vi khuẩn của canh trựng dựng chế vacxin thử nghiệm

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 50. Với vi khuẩn P.multocida và S.suis phát triển tốt trên môi trường BHI, broth nước thịt TYE và THB (Todd Herwitt Broth). - Sử dụng quy trình kiểm nghiệm vacxin chết có bổ trợ keo phèn theo tiờu chuẩn ngành (TCN) ủể kiểm nghiệm vacxin.

Kết quả kiểm tra ủậm ủộ vi khuẩn của canh trựng dựng chế vacxin thử. Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 51.

Kết quả kiểm tra chỉ tiêu thuần khiết của canh trùng chế tạo vacxin

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 52. Kết quả bảng 4.10 cho thấy: canh trựng của 3 lụ vacxin thử nghiệm ủều ủạt các chỉ tiêu về thuần khiết. Trên các môi trường nuôi cấy riêng biệt với từng loại canh trựng của 3 loại vi khuẩn khỏc nhau ở cả ba lụ vacxin I, II và III ủều chỉ cú duy nhất A.pleuropneumoniae, P.multocida và S.suis phát triển.

Kết quả kiểm tra chỉ tiêu vô trùng của vacxin

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 53. Từ kết quả bảng 4.11 cho thấy: trong cỏc loại mụi trường dựng ủể kiểm tra, không quan sát thấy bất cứ một loại vi khuẩn nào mọc qua thời gian 7 ngày theo dừi. Như vậy, 2 lụ vacxin chế thử nghiệm ủều ủạt cỏc chỉ tiờu về vụ trựng ở tất cả cỏc giai ủoạn: vacxin sau khi vụ hoạt bằng formalin 0,5%, vacxin sau khi bổ sung keo phèn, vacxin sau khi ra chai.

Kết quả kiểm tra chỉ tiờu an toàn và hiệu lực của vacxin trờn ủộng.

Kết quả kiểm tra chỉ tiờu an toàn và hiệu lực của vacxin trờn ủộng vật thí nghiệm

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 54. Kết quả thử hiệu lực của ba lô vacxin thử nghiệm trên chuột nhắt trắng ủược trỡnh bày ở bảng 4.13 cho thấy: ba lụ vacxin I, II ủều cú 9/10 chuột sống chiếm tỷ lệ 90% số chuột ủược bảo hộ. Theo quy trình kiểm nghiệm (2006), dành cho các vacxin vi khuẩn vô hoạt có formalin và keo phèn của bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, khi kiểm tra chỉ tiêu an toàn bằng phương pháp thay thế trên chuột: vacxin ủược coi là an toàn khi ủộng vật thớ nghiệm phải sống khỏe mạnh trong 10 ngày theo dừi sau khi tiờm vacxin với liều sử dụng.

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 55. Như vậy, so với quy ủịnh trờn, vacxin vụ hoạt phũng bệnh viờm phổi do A.pleuropneumoniae, P.multocida và S.suis ủược chế tạo ủảm bảo an toàn và có hiệu lực.

Kết quả xỏc ủịnh hiệu lực của vacxin phũng bệnh viờm phổi trờn lợn

- Ở lụ thớ nghiệm 1 cú 12 con lợn ủược tiờm vacxin sau 21 ngày, khi cụng cường ủộc với vi khuẩn A.pleuropneumoniae serovar 2 và 5 kết quả cho thấy với vi khuẩn A.pleuropneumoniae serovar 2 chỉ gây chết 1/3 lợn, tỷ lệ bảo hộ 66,7%; Với 3 lợn tiêm canh trùng của A.pleuropneumoniae serovar 5 với liều 5ml/con ủó khụng gõy chết lợn thớ nghiệm, ủạt tỷ lệ bảo hộ 100%. - Ở lụ ủối chứng 5: cú 6 con lợn ủược chia ra 3 nhúm khụng tiờm vacxin, khi cụng cường ủộc với cả 4 chủng vi khuẩn A.pleuropneumoniae serovar 2 và 5 và P.multocida serotype A và D với liều 5ml/con và 6ml/con ủều gõy chết 100% lợn ở lụ ủối chứng. - Ở lụ ủối chứng 6: cú 4 con lợn ủược chia ra 2 nhúm khụng tiờm vacxin, khụng tiến hành cụng cường ủộc thỡ lợn ủều khỏe mạnh.

Tiến hành lấy máu trước khi tiêm vacxin: 60 con lợn ≥ 6 tuần tuổi, lợn thí nghiệm âm tính hoặc chỉ có hiệu giá kháng thể 1/2, 1 + mới sử dụng làm lợn thí nghiệm. Kết quả này khẳng ủịnh sau khi tiờm vacxin lợn ủược bảo hộ là 4 thỏng với bệnh viêm phổi lợn do vi khuẩn A.pleuropneumoniae, P.multocida và S.suis gây ra.