Khả năng thu nhận enzym amylase của vi khuẩn từ rừng ngập mặn Cần Giờ

TINH BỘT VÀ HỆ ENZYM AMYLASE 1. Tinh bột

Nguyên liệu sử dụng cho nuôi cấy NS thu amylase thường là những nguyên liệu có nguồn gốc tự nhiên như cám mì, cám gạo, ngô mảnh, đậu nành và các loại hạt ngũ cốc khác. Nguồn dinh dưỡng nitơ để nuôi NS tạo amylase thường được dùng dưới các dạng muối vô cơ chủ yếu là NaNO3 hoặc NH4NO3 với hàm lượng 0,91% có hiệu quả cao hơn các loại muối khác. Các chất khoáng như Fe, Mn, Zn, Cu…có vai trò quan trọng như tham gia vào quá trình chuyển hóa vật chất qua màng và thành tế bào NS, tham gia vào thành phần cấu tạo protein, enzym, điều hòa các chất trong tế bào…[26].

Canxi là thành phần không thể thiếu được trong cấu tạo amylase vì nó cần cho quá trình tổng hợp và ổn định α-amylase, bảo vệ enzym này khỏi tác động của protease; Magie (Mg) ảnh hưởng đến độ bền nhiệt của enzym. Phospho ảnh hưởng đến sự sinh sản của NS, khi bổ sung phospho hữu cơ vào MT sẽ làm tăng giá trị dinh dưỡng MT và làm tăng tổng hợp amylase 2-3 lần; Tuy nhiên, nếu trong MT có nhiều Mn, Cu, Hg thì sẽ kìm hãm sự tổng hợp amylase [21]. Muối ăn NaCl ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng phát triển của VSV, ngoài tác dụng cung cấp nguồn ion Cl- còn có tác dụng làm thay đổi sức thẩm thấu của màng tế bào, tạo điều kiện cho việc tiết các chất ra MT [26].

Để tạo điều kiện cho NS sinh trưởng và phát triển tốt, tổng hợp nhiều amylase, người ta thường bổ sung thêm vào MT một số chất thích hợp như: nước chiết mầm mạch, nước chiết ngô,… Phương pháp này đòi hỏi phải có cánh khuấy hay máy lắc để đảo trộn MT cung cấp ôxy cho NS phát triển. Ngoài ra, amylase cũng được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi trong sản xuất đường bột, sản xuất dextrin, maltodextrin, nha glucose, siro, glucose – fructose, sản xuất tương và nước chấm …ở quy mô công nghiệp [29].

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Các phiến kính có khối thạch cấy NS nghiên cứu được đặt trong các hộp petri có sẵn một ít bông thấm nước được làm ẩm bằng nước cất vô trùng. - Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch thì tiến hành giải trình tự gen 28S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH để xác định chi và loài của chủng nghiên cứu [40]. Chất KS do NS sinh ra sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định làm cho VSV không phát triển được xung quanh lỗ khoan chứa dịch KS hay khối thạch chứa nấm tạo vòng vô khuẩn trong suốt.

+ MT9 sau khi hấp khử trùng để nguội 40oC, cho dung dịch huyền phù chứa VSV kiểm định vào lắc đều và đổ một lớp mỏng lên đĩa petri, để nguội. Ủ trong tủ ấm theo thời gian đã xác định ở trên rồi thu dịch enzym để tiến hành đo OD xác định nhiệt độ sinh enzym tối ưu của từng chủng. Thanh trùng MT, để nguội rồi cấy chủng NS, ủ trong điều kiện thời gian, nhiệt độ đã xác định ở trên rồi thu dịch enzym để tiến hành đo OD xác định pH sinh enzym tối ưu của từng chủng.

Thanh trùng MT, để nguội, rồi cấy chủng NS nghiên cứu, ủ trong điều kiện thời gian, nhiệt độ, pH đã xác định ở trên rồi thu dịch enzym để tiến hành đo OD xác định độ ẩm sinh enzym tối ưu của từng chủng. Thanh trùng MT, để nguội rồi cấy chủng NS nghiên cứu, ủ trong điều kiện thời gian, nhiệt độ, pH, độ ẩm đã xác định ở trên rồi thu dịch enzym để tiến hành đo OD xác định độ mặn sinh enzym tối ưu của từng.

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

Để đánh giá chính xác khả năng sinh enzym amylase của 10 chủng làm cơ sở cho sự tuyển chọn tiếp theo, chúng tôi tiến hành xác định hoạt độ α – amylase theo phương pháp Heinken trong phần 2.3.3.1 và xác định lượng đường khử trong phần 2.3.3.2 Kết quả trình bày trong bảng 3.4. Đó là, khi khảo sát khả năng sinh amylase các chủng tập trung nhiều ở lá và thân nhưng chủng có hoạt độ amylase cao lại là chủng ở đất (Chủng Đ10, Đ56). Mặc khác, khi nuôi NS trong MT xốp chứa cơ chất cảm ứng, có nguồn gốc tự nhiên dễ làm phát huy khả năng sinh amylase tối đa của một số chủng NS.

Để xác định khoảng nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng của 2 chủng NS tuyển chọn, chúng tôi cấy các chủng NS trên MT2, sau khi ủ 3 ngày ở các nhiệt độ khác nhau, chúng tôi thu được kết quả như bảng 3.7. Có lẽ đây là những chủng NS có khả năng thích nghi khá tốt với điều kiện sống nơi này nên sinh trưởng được với cả giới hạn nhiệt độ cao hơn mức bình thường. Để xác định khả năng sinh trưởng của 2 chủng NS nghiên cứu trong các nồng độ muối NaCl khác nhau, chúng tôi nuôi cấy NS trên MT1 theo phương pháp 2.3.3.3 có nồng độ NaCl thay đổi từ 0-20%.

Nguồn nitơ ở đây là các hợp chất protein vừa làm nguồn N và nguồn C, đồng thời còn cũng cấp các chất sinh trưởng cần thiết cho sự tổng hợp các sản phẩm và hệ enzym để tiến hành các phản ứng sinh hóa theo hướng có lợi (Nguyễn Đức Phẩm, 2004) [26]. Chúng là các VSV chịu mặn tùy tiện; có khả năng đồng hóa nhiều nguồn cacbon và nitơ khác nhau nên tham gia vào vòng tuần hoàn vật chất, khép kín chu trình sinh địa hóa, duy trì sự cân bằng sinh thái nơi này. Tuy nhiên, hai chủng NS ở RNM Cần Giờ có khả năng sinh trưởng tốt trong khoảng nhiệt độ từ 30 – 400C, cho nên chúng cũng tạo enzym có hoạt độ cao trong thời gian này là điều hợp lí, và có thể đây cũng là nét đặc trưng của chủng NS sống ở RNM Cần Giờ (nơi có khí hậu cận xích đạo).

Kết quả này, là hoàn toàn hợp lí vì đây cũng là nồng độ muối thích hợp cho sinh trưởng của hai chủng nấm đồng thời là độ mặn thường thấy tại RNM cần Giờ. Nhận định này của chúng tôi cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Lan Hương (2009) về khả năng chịu mặn của các NS sinh amylase tại RNM Cần Giờ. Chúng tôi tiến hành nuôi 2 chủng NS này trong những điều kiện tối ưu đã nghiên cứu, để xác định lại thời điểm thu amylase tốt nhất của chúng.

Chúng tôi tiến hành thu enzym của hai chủng tuyển chọn ở điều kiện tối ưu, tiến hành các phản ứng đường hóa và dextrin hóa của hai chủng này ở điều kiện nhiệt độ, pH tối ưu. Như vậy, sau khi tiến hành tối ưu một số yếu tố MT và điều kiện nuôi cấy, hoạt tính amylase của hai chủng tuyển chọn có phần tăng đáng kể. Để có thể hiểu được vai trò của các chủng NS tuyển chọn đối với hệ sinh thái RNM Cần Giờ và khả năng ứng dụng thực tiễn, chúng tôi đã tìm hiểu một số hoạt tính sinh học của các chủng vi nấm này.

Nhờ hệ enzym ngoại bào phong phú giúp phân giải tốt nguồn cơ chất nơi đây, các chủng NS này là mắt xích quan trọng trong chuỗi thức ăn và góp phần khép kín chu trình sinh địa hóa của RNM. Một đặc tính quý khác của NS là chúng có thể sinh các enzym phân giải các chất độc hại trong MT như dầu mỏ, các chất hóa học có cấu trúc mạch vòng trong phân tử.

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

Đoàn Văn Thược (2005), Tuyển chọn và nghiên cứu một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh amylaza trên bã sắn phế thải để sản xuất enzim cho chăn nuôi gia súc, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội. Phạm Thị Thanh Thúy (2007), Nghiên cứu khả năng phân giải Carbuahydro của một số chủng nấm sợi phân lập từ Rừng ngập mặn Cần Giờ, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐH Sư phạm Tp. Phạm Trọng Thịnh, Lê Trình (1997), Phân vùng sinh thái, quy hoạch môi trường gắn kết phát triển kinh tế- xã hội và bảo vệ hệ sinh thái rừng ngập mặn huyện cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh.

Phạm Hùng Vân (2009), PCR và real-time PCR Các vấn đề cơ bản và các áp dụng thường gặp, NXB Y học chi nhánh Tp. Nguyễn Thị Bích Viên (2009), Khảo sát một số đặc tính sinh học của một số chủng NS phân lập được từ RNM Cần Giờ, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐH Sư phạm Tp. Đa dạng sinh học, kinh tế xã hội và tuyên truyền giáo dục ở các vùng ven biển có rừng ngập mặn phục hồi tại Thái Bình và Nam Định (2001), Trung tâm nghiên cứu hệ sinh thái rừng ngập mặn, Hội thảo khoa học đề án EP-DRC/MERD năm 2001.

Phan Nguyen Hong, 2004, Mangrove Ecosystem in the Red River Coastal Zone, Agricultural Publishing House Hanoi. Phan Nguyen Hong, 2006, The role of mangrove and coral reef ecosystems in nature disaster mitigation and coastal life improvement, Agricultural Publishing House Hanoi.