Quy trình tách chiết và tinh sạch enzyme

Phương pháp lọc

Trong công nghệ enzyme, sau khi phá vỡ thành tế bào sinh vật hay sau khi lên men, người ta thường sử dụng quá trình lọc để thu nhận dung dịch enzyme nội bào, enzyme ngoại bào hòa tan. Lọc là một phương pháp khi thực hiện thường gặp nhiều khó khăn như kích thước vật chất dưới tế bào thường rất nhỏ, và độ nhớt của dung dịch thường rất cao.

Phương pháp nhiệt

Chúng ta có thể tiến hành cô đặc enzyme bằng phương pháp nhiệt, nhưng sử dụng nhiệt để cô đặc enzyme thường gặp rất nhiều khó khăn vì enzyme là protein rất nhạy cảm với nhiệt độ, nguyên nhân là hầu hết enzyme đều được tổng hợp trong tế bào (trừ enzyme nhân tạo). Enzyme mất hoạt tính là một trong những nguyên nhân làm tế bào chết, là vì khi đó các phản ứng trao đổi chất của tế bào sẽ không còn xảy ra nữa, sự trao đổi chất của tế bào bị ngưng trệ, tế bào không thể tồn tại.

Phương pháp kết tủa

* Phương pháp kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ: Dung môi hữu cơ có ảnh hưỡng rất lớn đến khả năng hòa tan của enzyme, ảnh hưởng solvate hóa của phân tử nước xung quanh phân tử enzyme bị thay đổi, tương tác giữa các phân tử enzyme sẽ bị tăng lên. Phương pháp này có ưu điểm là ta có thể thực hiện quá trình kết tủa enzyme ở nhiệt độ bình thường (nhiệt độ phòng thí nghiệm) và lượng polyethylene glycol cần sử dụng để kết tủa không nhiều (khoảng 5 – 15 %).

Phương pháp siêu lọc

Kết tủa enzyme ở điểm đẳng điện thường được thực hiện ở quy mô nhỏ, chứ không thực hiện ở quy mô công nghiệp. Thời gian tạo điểm đẳng điện và thời gian lưu để tạo kết tủa bền vững thường làm thay đổi hoạt tính enzyme.

Phương pháp điện di

Khi đó, thời gian khuấy trộn và thời gian lắng kết tủa càng dài, enzyme càng dễ bị biến tính. Người ta cũng đã tiến hành áp dụng thử phương pháp này theo quy mô công nghiệp nhưng cho đến nay vẫn chưa được phát triển rộng rãi.

Phương pháp thu nhận một số enzym quan trọng từ vi sinh vật(VSV)

Chế độ thông khí có thể liên tiếp, gián đoạn (hoặc không khí tự nhiên) tùy thuộc vào chiều dày của lớp môi trường nuôi, vào khoảng cách giữa các tầng khay và dây khay thường là giai đoạn sinh truởng thứ nhất phải thông khí vào phòng nuôi khoảng 4-5 lần thể tích không khí trên một thể tích phòng trong một giờ, còn giai đoạn thứ hai là 30-60 thể tích không khí trên thể tích phòng nuôi/1 giờ, còn giai đoạn thứ ba giảm đi còn 10-12 thể tích không khí. Thành phần môi trường nuôi cấy cạ khuẩn và nấm sợi rất đa dạng, trong đó vừa phải đủ chất dinh dưỡng, vừa phải có cơ chất là cellulase và phải có độ xốp nhất định để không khí có thể lưu thông từ bên ngoài môi trường vào trong khối môi trường.Cả hai nhóm xạ khuẩn và nấm sợi đều là những VSV hiếu khí nên trong quá trình nuôi thường xuyên phải được cung cấp oxy.

Các hướng ứng dụng

Trong những quá trình này, sản phẩm cuối cùng thường là hỗn hợp nhiều chất , trong đó có thể tồn tại một hay hai chất chiếm số lượng lớn, những chất này được tạo thành trên cơ sở số lượng lớn, hoạt tính enzyme tham gia tạo ra chúng có trong tế bào sống vượt trội hơn so với những enzyme khác. Ứng dụng enzyme trong tế bào VSV theo hướng thứ nhất này không chỉ có ý nghĩa trong công nghệ sản xuất các sản phẩm lên men truyền thống, các quá trình ủ mà còn có ý nghĩa rất lớn trong xử lý nước thải công nghiệp, nước thải sinh hoạt và nước thải bệnh viện.

Ứng dụng enzyme trong công nghệ thực phẩm

• Một số enzyme quan trọng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm .1 Oxidoreductase
• Ứng dụng enzyme trong công nghệ thực phẩm 1.Ứng dụng trong chế biến bột và sản xuất kẹo

Trong quá trình sản xuất các sản phẩm từ đậu nành, các chất bay hơi(hexanal.) sẽ làm gây mùi “đậu”. Việc làm giảm lượng các chất được thực thi nhờ quá trình oxy hóa các acid béo không no bão hòa bởi enzyme aldehyde dehydrogenase. Enzyme này chuyển đổi các goc aldehyde thành cacboxylic. Với lượng acid hình thành từ quá trình chuyển đổi chưa làm ảnh hưởng đến mùi vị sản phẩm. Enzyme này chiết xuất từ một số vi khuẩn như Aerobacter có khả năng làm giảm các diketone, làm giảm hàm lượng diacetyl, chất 2,3-butanediol hình thành không gây mùi khó chịu cho sản phẩm. Protease có khả năng thuỷ phân protein thành acid amin, peptid mạch ngắn, pepton. Protease có tầm quan trọng sống còn với toàn bộ sinh giới, chiếm gần 25% tổng số gene mã hoá cho nó. Protease cần thiết cho sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ cấp độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật, thực vật, động vật. So với protease động vật và thực vật, protease VSV có những đặc điểm khác biệt. Hệ protease VSV là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về mặt cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất. Nó cũng là phức hệ nhiều enzyme khác nhau nên protease VSV thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng. Protease động vật và thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase exopeptidase, riêng VSV lại có khả năng sinh 2 loại trên do đó protease của VSV có tính đặc hiệu cơ chất. Chúng có khả năng thuỷ phân 80% các lien kết peptide trong phân tử protein. Trong công nghiệp sản xuất người ta thường sản xuất chế phẩm hỗn hợp giữa trypsin và chymotrypsin. Chế phẩm này thường được sản xuất từ tuyến tuỵ Trong chế phẩm này có cả peptidase khác, enzyme amylase, lipase. Chế phẩm này hoạt động mạnh ở pH. Một số enzyme thường được sử dụng là:. - Pepsin: Được thu nhận từ màng nhầy dạ con của heo con và bê. Pepsin thường được sử dụng chung với renin trong sản xuất phô mai và làm thuốc tiêu hoá. - Renin: Thường được sản xuất từ bao tử của cừu. Đây là loại enzyme có hoạt tính đạc biệt rất cao. Nguời ta thường phối trộn với pepsin theo tỷ lệ 1:1 trong công nghiệp chế biến sữa. - Papain: Người ta thu nhận enzyme này bằng cách sấy khô mủ cây đu đủ carica papaya. Trong mủ quả đu đủ có chứa papain, chymopapain và một lượng nhỏ protease khác. Enzyme này được ứng dụng trong công nghiệp sản xuất bánh, trong sản xuất bia và trong chế biến thịt. Ngoài ra còn sử dụng trong y tế để làm lạnh các vết thường ngoài da. Papain bị mất hoạt tính khi pH 3,0 với sự có mặt của oxy. - Bromelin: Được sản xuất từ vỏ và chồi của quả dứa. Tuy nhiên chế phẩm bromelin thường không ổn định bằng papain. - Ficin: Enzyme này thường có nhiều trong nhựa của cây sung. Đặc tính enzyme ficin gần giống papain. Ficin được ứng dụng nhiều trong công nghệ chế biến sữa. b)Proteinase của vi khuẩn. Đặc điểm quan trọng nhất của enzyme amylase là chúng hoạt động ở pH gần trung tính (pH 6). Đặc điểm này giúp ta thực hiện quá trình đường hoá rất dễ dàng. Đặc điểm kỹ thuật của công đoạn sản xuất siro fuctose được trinhg bày trong bảng dưới đây:. Bảng 3.1: Điều kiện chuyển hoá tinh bột thành đường trong công nghệ sản xuất siro fructose. Các công đoạn. Hàm lượng enzyme. Hàm lượng Ca2+. tinh bột -Dịch hoá lần 1. íomerase se 4 Làm giàu. Trong đó giai đoạn dịch hoá và đường hoá đóng vai trò rất quan trọng. Các giai đoạn này thường quyết định các giai đoạn sau và quyết định đến chất lượng sản phẩm. Trong quá trình sản xuất siro fructose, nhiều nước trên thế giới có sử dụng enzyme cố định amyloglucosidase và pullulanase. Phương pháp này được thực hiện ở nhiệt độ 60oC và hàm lượng chất khô trong dịch khoảng 30-35%. Ngoài công nghệ sản xuất siro fructose từ nguyên liệu ban đầu là bột ngô, người ta còn tiến hành quá trình isomer hoá glucose để sản xuất fructose. Bánh mì là một loại lương thực chính của Châu Mỹ và Châu Âu, trong vài thập niên gần đây bánh mì được coi như khẩu phần lương thực của người Việt Nam. Nguyên liệu chính để làm bánh mì là bột từ lúa mì. Trong sản xuất bánh mì, enzyme được xem là chất phụ gia vào quá trình làm bánh để tăng chất lượng bánh mì. Enzyme được thêm vào nhằm giải quyết một số vấn đề sau:. - Làm tăng nhanh thể tích bánh. - Làm màu sắc của bánh đẹp hơn - Làm tăng mùi thơm cho bánh. Sự tác động tương hỗ giữa khả năng chuyển hoá cua enzyme vào trong quá trình chế biến và hoạt động của nấm men sẽ làm tăng nhanh chất lượng bánh mì và dảm bảo được những mục đích trên. Trong sản xuất bánh mì, người ta sử dụng những loại enzyme sau:. • Enzyme protease: Enzyme này được sử dụng trong sản xuất bánh mì nhằm làm giảm độ nhớt của bột nhào do gluten gây ra, làm tăng hệ số tiêu hoá của protein. Protease được sử dụng trong sản xuất bánh mì là protease trung tính. • Enzyme β-amylase, α-amylase: Trong sản xuất bánh mì người ta sử dụng cả α,β- amylase, các loại enzyme này tham gia thuỷ phân tinh bột để tạo thành đường. Nhờ đó nấm men Sacharomyces cerevisiae mới dễ dàng chuyển hoá chúng thành cồn, CO2 làm tăng thể tích của bánh và tạo ra màu sắc, hương vị tốt cho bánh. Chất lượng bánh mì không chỉ phụ thuộc vào CO2 tạo ra nhiều hay ít mà phụ thuộc vào động thái của quá trình tạo ra nó. Trong công nghệ sản xuất bánh mì lượng CO2 phải được tạo ra liên tục đặc biệt phải được ổn định 10-15 phút đầu khi đưa bánh vào lò. Khi trong bột có β-amylase hoạt động thì tạo thành CO2 trong quá trình chuẩn bị bột nhào xảy ra theo chiều hướng tăng và đạt cực đại vào giai đoạn thứ 4 của quá trình lên men. Quá trình này rất thuận lợi phù hợp với yêu cầu kỹ thuật của sản xuất bánh mì. Như vậy, việc duy trì tạo thành lượng khí liên tục như vậy là do hoạt động của enzyme amylase. Mặt khác trong quá trình chuyển hoá tinh bột có trong bột mì, một số loại đường được tạo thành như glucose, frutose và maltose. Trong đó maltose có ý nghĩa quan trọng đối với chất lượng bánh. Ý nghĩa của việc sử dụng chế phẩm enzyme trong quá trình sản xuất bánh mì là khi sử dụng enzyme, nhờ hoạt động của nó mà lượng đường tạo thành từ từ, không tập trung qua nhiều ở giai đoạn đầu hoặc ở giai đoạn cuối của quá trình nhào bột. Chính vì thế enzyme như một chất điều hoà có hiệu quả quá trình lên men, tạo CO2 trong quá trình kỹ thuật. Như vậy ở một góc độ nào đó trong quá trình sản xuất ta sử dụng enzyme như là một yếu tố điều khiển kỹ thuật cho quá trình sản xuất này. Các enzyme thuỷ phân protein được ứng dụng như một tác nhân làm giảm độ nhớt trong bột nhào. Nhờ đó tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của nấm men và quá trình tạo CO2 vừa ổn định vừa cao, đảm bảo việc tạo thành phản ứng Melanoidin trên vỏ bánh khi nướng. Tuy nhiên nếu sử dụng proteae có hoạt tính quá mạnh, cấu trúc gluten sẽ bị phá huỷ và khi đó khả năng giữ khí sẽ giảm, cấu trúc bánh dễ bị thay đổi, bánh có nở nhưng nhanh chóng teo lại khi nhiệt độ về nhiệt độ thường. Mục đích của việc sử dụng enzyme vào sản xuất các loại bánh quy là làm tăng mùi và vị của bánh. Khi chế biến bột thành các loại bánh qui, enzyme protease và amylase của bột hoạt động nhằm làm tăng hàm lương amino acid tự do và làm tăng lượng đường khử. Đường khử và amino acid có trong bột sẽ cùng tham gia phản ứng oxy hoá- khử và kết quả tạo cho bánh có mùi, vị và màu hấp dẫn. Tuy nhiên nếu sử dụng lượng enzyme có sẵn trong bột thì phản ứng trên xảy ra không mạnh, nhất là khi sử dụng loại bột xấu để làm bánh. Do đo, người ta thường cho thêm enzyme protease và amylase vào chế biến bột trong quá trình sản xuất bánh quy. Các sản phẩm của quá trình này gồm kẹo viên, bánh quy kem với nhân trái cây, các loại kẹo mềm. Ở Nga, khi sản xuất các sản phẩm bánh kẹo người ta sử dụng enzyme invertase. Ứng dụng pectinase sản xuất nước quả và rượu vang a) Các chế phẩm enzyme. Trong sản xuất nước quả và rượu vang người ta sử dụng một trong 6 nhóm enzyme sau:. o Nhóm chế phẩm enzyme dùng để sản xuất nước quả đục. Mục đích của việc sử dụng chế phẩm enzyme này là làm tăng hiệu suất trích ly để thu được lượng sản phẩm lớn. o Nhóm chế phẩm dùng cho sản xuất nước quả trong không chứa pectin. Mục đích của việc sử dụng chế phẩm này là làm tăng hiệu xuất trích ly và thuỷ phân hoàn. toàn các chất protein, pectin, làm giảm độ nhớt và làm triệt tiêu nguyên nhân làm đục nước quả. o Nhóm chế phẩm enzyme dùng để làm tăng khả năng đồng hoá nước quả và thịt quả, làm tăng khả năng trích ly nước quả. o Nhóm sản phẩm dùng để sản xuất bán sản phẩm rượu vang nhằm làm tăng hiệu suất trích ly của bán sản phẩm. o Nhóm sản phẩm enzyme dùng để ngăn cản quá trình oxy hoá và làm cản trở sự phát triển của VSV hiếu khí phát triển trong nước quả, trong rượu vang. o Nhóm chế phẩm enzyme dùng vào mục đích chống lại sự lại đường trong sản xuất siro thành phẩm. Một số lưu ý khi sử dụng enzym trong chế biến:. - Sự có mặt của enzyme ascorbinatoxidase thường gây ra sự phân giải vitamin C. - Các enzyme tham gia quá trình oxy hoá như phenoloxidase, peroxidase, catalase thường làm biến màu nước quả và làm giảm giá trị cảm quan khác. Do đó, trong chế biến nước quả không nên dùng loại enzyme này. - Khi chế biến nước quả có màu đỏ cần lưu ý phải bảo tồn chất màu antocian. Chính vì thế không dùng enzyme có khả năng phân giải antocian. - Acid ascorbic là một chỉ tiêu quan trọng của nước quả, do đó khi chế biến nước quả tuyệt đối không sử dụng enzyme ascorbicnatoxidase. - Trong nhiều trường hợp, enzyme protease đóng vai trò làm trong nước quả. Chính vì thế, khi cần làm trong nước quả người ta thường kết hợp protease acid với enzyme phân huỷ pectin. - Khi chế biến nước quả có thịt quả, người ta sử dụng chế phẩm enzyme. pectintrancelimitase, hemicellulase, cellulase. Trong đó, enzyme pectintrancelimitase đóng. vai trò quan trọng nhất. Trong chế phẩm enzyme này tuyệt đối được có mặt của enzyme polygalacturonase, đặc biệt là không chứa enzyme endopolygalacturonase. Những enzyme này thường làm độ nhớt của nước quả và phá vỡ đồng nhất nước quả. b) Cơ chế tác động của enzyme pectinase.

Ứng dụng enzyme trong các ngành khác .1Ứng dụng enzym trong chữa bệnh

• Ứng dụng enzyme để tạo các dược phẩm

- Người ta đã chứng minh được bằng thực nghiệm ý tưởng của phương pháp sinh học nhờ ánh sáng mặt trời và các quá trinh sinh học để chuyển hóa 1 cách liên tục năng lượng mặt trời từ dạng bức xạ về dạng dự trữ (nhiên liệu hydro). - Những enzyme này không bền pH kiềm và nhiệt độ cao trong một thời gian lâu, nên người ta thường bao chúng lại trước khi phối trộn với các thành phần khác của chất tẩy rửa để bảo quản được lâu và đảm bảo khả năng hoạt động của chúng.