Quy trình phát hiện virus PMWaV-1 gây bệnh héo đỏ đầu lá trên cây dứa Cayenne bằng phương pháp RT-PCR
MỤC LỤC
Mục đích
Xây dựng qui trình phát hiện virus PMWaV-1 gây bệnh héo đỏ đầu lá trên cây dứa Cayenne bằng phương pháp RT-PCR.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương pháp nghiên cứu .1 Tách chiết RNA
Thờm 700 àl ethanol 70% vào mỗi tube, hũa tan bằng pipet cho đến khi dung dịch không còn phân lớp. Cho 700 àl dịch rửa low stringency vào RNA binding column, ly tõm 30 giây, loại bỏ dịch lọc. Cho 700 àl dung dịch high stringency vào RNA binding column, ly tõm 30 giây, loại bỏ dịch lọc.
Mẫu sản phẩm RNA trước khi điện di được làm biến tính ở 65oC trong 30 phút rồi làm lạnh nhanh trong nước đá khoảng 1 phút. PMWaV-1, cặp primer 225, 226 được kiểm tra các cấu trúc thứ cấp bằng phần mềm trực tuyến Oligo Analyzer của hãng IDT (http://www.scitools.idtdna.com/scitools/Applications/OligoAnalyzer/) và được kiểm tra độ đặc hiệu cho PMWaV-1 bằng công cụ BLAST của NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Primer 226 sẽ thực hiện phản ứng reverse với tác động của enzyme reverse transcriptase, tổng hợp sợi cDNA từ RNA của PMWaV-1.
Sau đó dưới tác động của Taq – polymerase, cả hai primer 225 và 226 sẽ hoạt động, khuếch đại các cDNA vừa tạo. Với nguyên tắc trên, phản ứng RT-PCR tối ưu sẽ được khảo sát dựa trên 5 chu trình sau. Sản phẩm PCR được đem điện di trên gel agarose 1.5% với hiệu điện thế 50V trong 90 phút.
Kích thước các sản phẩm PCR được ghi nhận thông qua sự so sánh với thang chuẩn 100 bp DNA ladder (Promega). Những mẫu khuếch đại có chứa band với kích thước 600 bp, tương đương với đoạn 589 bp trên lý thuyết, sẽ là những mẫu dương tính - bị nhiễm PMWaV-1. Để kiểm tra độ đặc hiệu của sản phẩm RT-PCR, có 2 mẫu sản phẩm RT-PCR dương tính trên điện di, 1 của cây bệnh, 1 của chồi dứa thương phẩm (không có triệu chứng bệnh) được đem giải trình tự.
Do hạn hẹp về thời gian thực hiện đề tài, chúng tôi không thể trực tiếp tiến hành giải trình tự nên gửi mẫu sản phẩm RT-PCR sang công ty Macrogene – Hàn Quốc để thực hiện. Sau đó, trình tự sẽ được so sánh với dữ liệu của đoạn gene mã hóa cho HSP 70 của PMWaV-1 trên GenBank bằng các phần mềm Clustal X 1.83 và BLAST. Áp dụng quy trình đã xây dựng được, tiến hành giám định trên 3 giống dứa Thái Lan, Trung Quốc, Lâm Đồng, mỗi giống gồm 30 mẫu chồi giống dứa thương phẩm được lấy ngẫu nhiên từ các nông trường.
KẾT QUẢ – THẢO LUẬN
- Kết quả xây dựng quy trình RT-PCR
Các thông số này của cặp primer 225, 226 hoàn toàn phù hợp với các yêu cầu cơ bản để một cặp primer hoạt động hiệu quả trong phản ứng RT-PCR như: nhiệt độ. Theo hãng IDT, các cấu trúc thứ cấp có năng lượng tự do lớn hơn -9 kcal/mole sẽ hầu như không ảnh hưởng đến hoạt động của phản ứng PCR, còn các cấu trúc có năng lượng tự do nhỏ hơn -9 kcal/mole đòi hỏi phải cung cấp một nhiệt độ khá cao mới có thể phá vỡ chúng. Tuy nhiên, trong quá trình thí nghiệm, có lẽ do không phù hợp với hóa chất của bộ kit Access RT-PCR System (Promega) mà chúng tôi sử dụng nên quy trình này cho hiệu quả khuếch đại không như mong đợi.
Tuy nhiên, hiệu quả khuếch đại của chu trình này không cao, phản ứng chủ yếu xảy ra sự bắt cặp không chuyên biệt nên kết quả điện di cho thấy cường độ sáng của vạch sản phẩm phụ rất lớn, trong khi vạch sản phẩm chính lại khá mờ. Khi lượng bản sao mục tiêu đã tăng lên đến mức cần thiết, các chu kỳ sau được thiết lập với một điều kiện thuận lợi hơn (bắt cặp ở 54oC), giúp phản ứng khuếch đại xảy ra dễ dàng hơn. Sau khi đã xác định được yếu tố chính của phản ứng RT-PCR là quy trình nhiệt, chúng tôi tiến hành xác định các yếu tố khác để tối ưu hóa phản ứng RT-PCR.
Đối với quy trình đang thiết lập, việc xác định nồng độ RNA sau khi ly trích rất khó thu được kết quả chính xác nên chúng tôi chỉ thay đổi nồng độ primer để làm thay đổi tỷ lệ primer – RNA. Kết quả điện di trên cho thấy, với 2 nồng độ primer 1 mM và 0,8 mM phản ứng RT-PCR đều cho vạch sản phẩm chớnh sỏng và rừ nột, nhưng nồng độ 0,8 mM cho lượng sản phẩm phụ ít hơn. Tuy nhiên, quy trình RT-PCR trên được xây dựng với mục đích phát hiện PMWaV-1 trên những mẫu chồi với lượng bản sao RNA virus ban đầu rất thấp nên chúng tôi quyết định chấp nhận lượng sản phẩm phụ cao để tăng độ nhạy cho phản ứng.
Bên cạnh đó, ở các phản ứng đối chứng âm (giếng (-), hình 4.3) không thấy có sản phẩm khuếch đại, chứng tỏ trong quá trình thao tác không xảy ra sự ngoại nhiễm. - Trên RNA của cây dứa (thu được chung với của PMWaV-1 trong quá trình ly trích RNA tổng số) có những đoạn trình tự cũng gần như bổ sung với cặp primer 225, 226 nên trong phản ứng, ngoài đoạn HSP 70 của PMWaV-1 thì đoạn trình tự này cũng được nhân bản. Tuy nhiên, lượng sản phẩm phụ đã được làm giảm đi nhiều, còn sản phẩm chính đã đạt được mức khuếch đại cần thiết để có thể đánh giá chính xác sự hiện diện của PMWaV-1.
Do trong các quá trình giải trình tự trực tiếp trên sản phẩm PCR, máy thường không đọc được một số nucleotide đầu tiên nên trình tự của các sản phẩm PCR giải ra bị mất một đoạn khoảng 20 nucleotide về phía đầu 5’, nơi primer xuôi bắt cặp vào. Thường ở đầu và cuối đoạn DNA được giải trình tự, các tín hiệu huỳnh quang mà máy thu được thường bị nhiễu nên đoạn này máy thường đọc trình tự không chính xác hoặc không xác định được trình tự tạo ra các N. Bước tiếp theo, 2 đoạn trình tự vừa giải được đem so sánh với các trình tự chuẩn đã được công bố trên GenBank để có thể khẳng định đó chính là trình tự HSP 70 của PMWaV-1.
Ở đây, chúng tôi xin trình bày kết quả với 5 trình tự có độ tương đồng cao nhất đối với đoạn gene đang xét (trên tổng số 15 trình tự thu được – Phụ lục 3). Áp dụng quy trình RT-PCR đã xây dựng được, chúng tôi tiến hành giám định PMWaV-1 trên 90 mẫu chồi giống dứa Cayenne thương phẩm thuộc 3 giống Thái Lan, Trung Quốc, Lâm Đồng, mỗi giống gồm 30 chồi được thực hiện phản ứng RT-PCR và đọc kết quả bằng điện di.
