Ảnh hưởng của nông độ đa lượng đến sự hình thành và phát triển chồi của giống lan Dendrobium Sonia và Phalaenopsis Yubidan trong hệ thống nuôi cấy ngập tạm thời
MỤC LỤC
Đặc điểm thực vật
Bao hoa dạng cánh, rời nhau, xếp thành hai vòng: ba mảnh vòng ngoài và hai mảnh vòng trong bé hơn, mảnh thứ ba có hình dạng và màu sắc khác hẳn gọi là cánh môi. Trong thực nghiệm, người ta có thể đánh thức các “phôi sơ khai” (protocorm) khi sử dụng sốc thẩm thấu bằng cách nuôi cấy hạt trên môi trường chứa sucrose (Bùi Trang Việt, 2002).
Điều kiện sinh thái
Thêm vào đó, công nghệ lai giống và gieo hạt ngày càng tạo nên nhiều chủng loại giống mới, nổi bật về màu hoa, kích thước hoa… Điều này làm cho người tiêu dùng rất thích thú với thú chơi lan và tạo nên những cơn sốt hoa lan trên thị trường thế giới. Lan Hồ điệp là loài hoa đẹp, có giá trị kinh tế cao, là sản phẩm được cả thị trường trong nước và thế giới ưa chuộng, là loài lan nhiệt đới, đơn thân, chu kỳ sinh trưởng ngắn (thời gian từ trồng đến ra hoa khoảng 18-20 tháng tùy thuộc điều kiện chăm sóc và vùng trồng), dễ áp dụng sản xuất theo qui mô công nghiệp.
Giới thiệu về giống lan Dendrobium 1. Phân loại
Điển hình là Công ty Lâm Thăng của Đài Loan đầu tư và Công ty Kim Ngân chuyên trồng về lan Hồ điệp, hàng năm có thể cung ứng cho thị trường từ vài ngàn đếm vài chục ngàn cây, nhất là vào dịp Tết Nguyên Đán. Dendrobium là giống ưa ánh sáng, có thể trồng trong điều kiện ánh sáng trực tiếp hay ánh sáng khuếch tán, ánh sáng hữu hiệu cho giống Dendrobium là 70%, vì thế giàn che với độ che sáng 30% dưới đất, và 40% ở trên cao như sân thượng thích hợp cho sự phát triển.
Các kỹ thuật nhân giống trên cây lan 1. Phương pháp nhân giống truyền thống
Kỹ thuật nhân giống in vitro a. Lịch sử
Tuy ông đã gặp thất bại trong nuôi cấy các tế bào đã phân hoá tách từ lá một số cây một lá mầm: Erythronium, Ornithogalum, Tradescantia (do cây một lá mầm là đối tượng rất khó nuôi cấy, hơn nữa ông dùng các tế bào mất khả năng tái sinh). Nhược điểm quan trọng nhất trong vi nhân giống trên môi trường bán rắn được xem là tỷ lệ sống sót của cây thấp sau khi được chuyển ra vườn ươm bởi vì sự khác biệt lớn giữa điều kiện in vitro và ex vitro và sự cần thiết phải nuôi cấy vô trùng bắt buộc phải sử dụng các loại trang thiết bị chuyên biệt và đắt tiền.
Một số hệ thống nuôi cấy in vitro mới a. Nuôi cấy lỏng lắc
Nói chung, đây là một hiện tượng liên quan đến sự rối loạn trong hình thái và sinh lý của thực vật trong quá trình tăng trưởng in vitro, kết quả làm mất đi khả năng phát triển bình thường, và sau đó kéo theo hàng loạt các vấn đề trong suốt quá trình thích nghi của thực vật khi ra vườn ươm. Các vấn đề nêu trên biểu hiện nghiêm trọng hơn đối với nuôi cấy lỏng và cần phải cú những nghiờn cứu sõu hơn để hiểu rừ cũng như cú thể kiểm soỏt được sự phát sinh hình thái trong nuôi cấy bioreactor - một mô hình lớn của nuôi cấy lỏng.
Ứng dụng của kỹ thuật nhân giống in vitro
Các biểu hiện sai hỏng, chẳng hạn như thừa nước, lá và chồi kém phát triển, phôi bất thường, rối loạn quá trình phát sinh phôi đều là kết quả của sự gián đoạn hay mất tín hiệu trong trình tự của quá trình tái tạo cơ quan ở thực vật. Đây là phương pháp nuôi cấy dựa trên một bình nuôi cấy được thiết kế chuyên biệt nhằm mục đích nhân số lượng lớn tế bào, mô hay cơ quan trong môi trường lỏng có hệ thống làm thoáng khí.
HỆ THỐNG BIOREACTOR TRONG NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 1. Giới thiệu chung
Cấu trúc và phân loại bioreactor 1. Caáu truùc bioreactor
Hiện nay, tuy kích thước bioreactor nuôi cấy tế bào thực vật không ngừng tăng lên nhưng cấu trúc của chúng vẫn tương tự các bồn lên men vi sinh vật. Gần đây các bioreactor 500 lít được sản xuất để sản xuất chồi Stevia rebaudiana (cây cỏ ngọt) và tạo ra khoảng 200.000 cây con trong 1 mẻ nuôi cấy trước khi chuyển ra đất.
Các kiểu bioreactor
Loại bioreactor này thích hợp cho nuôi cấy nhiều loại cây khác nhau thông qua quá trình nuôi cấy chồi, thân củ, rễ củ… (Takayama, 1991). Hơn nữa, việc chia bioreactor sủi bọt hình cột thành. nhiều phần và cài đặt nhiều bộ phận sủi bọt khí sẽ đẩy nhanh tốc độ tăng sinh khoái. Những hạn chế chung của cả air-lift bioreactor và bioreactor sủi bọt hình cột: a) có bọt nổi lên do tăng cường một lượng khí lớn, b) các tế bào có khuynh hướng bị tống ra khỏi dung dịch bởi bọt khí, c) tế bào lớn lên trên thành của bình nuôi cấy (trong bọt). Như vậy, để nhân giống với số lượng lớn đồng thời cả phôi soma và mô thực vật phát sinh cơ quan một cách có hiệu quả thì cấu trúc bioreactor và thể tích môi trường phải được thiết lập sao cho phù hợp với các yêu cầu về sự khuấy trộn và hiếu khí của từng loại mô thực vật được nuôi cấy, cũng như phải làm sao giảm được tối thiểu cường độ cọ sát giữa các mẫu.
Qui trình nhân sinh khối thực vật bằng bioreactor
Bước III: là bước giúp tạo rễ và làm cứng cáp cây con, đây là bước cần thiết, tuy nhiên không phải áp dụng cho tất cả các loài, ở một số loài có thể bỏ qua bước này. Quá trình nhân giống cho hệ thống nuôi cấy bioreactor như sau: thiết lập điều kiện nuôi cấy vô trùng cho mẫu mô hay đỉnh sinh trưởng, sau đó chuyển vào môi trường có nồng độ cytokinin cao để kích thích hình thành cụm chồi.
Sự phát triển của thực vật trong bioreactor 1. Quá trình phát sinh phôi soma
Sự phát sinh phôi soma trong nuôi cấy lỏng lắc và bioreactor đã được công bố ở cây cà rốt, cây carum (họ hoa tán), cây trạng nguyên, cây cỏ linh lăng, cây caàn taây, caây Eschcholtzia californica, caây Octea catharinensis, caây khoai lang, caây cao su và cây vân sam (spruce). Tuy nhiên, để đạt được mục đích cuối cùng là tạo hạt nhân tạo thì trong số những giống cây trên, quá trình tạo phôi soma trong nuôi cấy lỏng lắc, bioreactor chỉ mới thành công trên một số loài như ở cây cà rốt, cây cỏ linh lăng, cây cần tây, và cây vân sam trắng và hiện nay đang khảo sát trên một số loài cây khác (Ziv, 1999).
Một số vấn đề thường gặp trong nuôi cấy lỏng
Nói chung, đây là một hiện tượng liên quan đến sự rối loạn trong hình thái và sinh lý của thực vật trong quá trình tăng trưởng in vitro, kết quả làm mất đi khă năng phát triển bình thường, và sau đó kéo theo hàng loạt các vấn đề trong suốt quá trình thích nghi của thực vật khi ra vườn ươm (Paques và Boxus, 1987). Chẳng hạn như giảm độ ẩm tương đối bằng cách tạo sự trao đổi khí bên trong và bên ngoài của bình nuôi cấy, tăng nồng độ agar trong môi trường nuôi cấy, sử dụng các chất hấp thụ ethylen như bột than, KMnO4, hoặc alginate STS, sử dụng các loại bình nuôi cấy lớn hơn tạo một sự thoáng khí cưỡng bức hay bổ sung các chất chống thủy tinh thể (anti- hyperhydricity) có bán trên thị trường, tên thương mại là EM2 (A0807, Sigma- Aldrich, Pool, Dorset, UK), M-Gel (Migros, Immensee, Switzerland), iota-type carrageenan (C1006, batch no 29225, Duchefa Biochemie BV, Haarlem, the Netherlands).
Các thông số vật lý ảnh hưởng đến mô thực vật nuôi cấy trong hệ thống bioreactor
Chẳng hạn như dựa trên những phân tích chi tiết về thành phần dinh dưỡng khi nuôi cấy củ Lilium trong hệ thống bioreactor sục khí dạng hình cầu, tác giả nhận thấy rằng sau 16 tuần nuôi cấy, các muối ammonium, nitrate, phosphate hầu như cạn kiệt, trong khi các ion K+, Mg2+, Ca2+, Na+ và Cl- vẫn còn một lượng trong môi trường. Qua nhiều nghiên cứu khác nhau về sử dụng bioreactor trong nuôi cấy thực vật, người ta kết luận rằng không có một mô hình nào thích hợp cho tất cả các đối tượng, mà các giải pháp sẽ được lựa chọn dựa trên các loại mô, đối tượng thực vật nuôi cấy cũng như quy mô và tính kinh tế của việc sản xuất.
Một số thành tựu trong ứng dụng hệ thống bioreactor
Một số báo cáo gần đây của Takayama và Akita (1998) nói về một vài kỹ thuật sử dụng bioreactor trong nhân giống tạo số lượng lớn các giống khoai tây, hoa lay-ơn, hoa lily, dâu tây, cây lan dạ hương, hoa loa kèn đỏ và một vài giống Araceae. Hiện nay trên thế giới, người ta đã thành công trong việc sử dụng bioreactor trong nuôi cấy huyền phù tế bào như cây Thông Đỏ, cây Dừa Cạn, cây Sâm Triều Tiên, cây Lan Gấm,… với thể tích của bình nuôi cấy từ vài chục lít lên đến vài chục ngàn lít.
Thuận lợi và khó khăn trong nuôi cấy bioreactor 1. Thuận lợi
Ứng dụng nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống vô tính cây trồng và sản xuất các sản phẩm thứ cấp trên qui mô công nghiệp là một trong những lĩnh vực quan trọng nhất của công nghệ tế bào thực vật (Dương Công Kiên, 2002). Một số sản phẩm quan trọng như Alkaloid: Morphinan Alkaloid, Berberine, Tropane Alkaloid, Cardinolides; Các hợp chất kháng ung thư: Camptothecin, Homoharringtonine, Podophyllotoxin, Vinca Alkaloid, Taxol, Nhaân saâm,….
GIỚI THIỆU HỆ THỐNG NUÔI CẤY NGẬP TẠM THỜI TIS 1. Giới thiệu
Nguyên tắc vận hành và cấu trúc cơ bản hệ thống
Tất cả các hệ thống này đều tuân theo những điều kiện được đề ra bởi Teisson và cộng sự năm 1999: (1) tránh sự ngập liên tục là yếu tố ảnh hưởng tiêu cực lên sự sinh trưởng và phát sinh hình thái của mẫu cấy; (2) cung cấp sự trao đổi oxy một cách đầy đủ; (3) cung cấp sự hòa trộn đầy đủ; (4) có thể thay đổi môi trường và điều khiển tự động; (5) hạn chế sự nhiễm; (6) giá thành hạ. Các hệ thống đều có ngăn chứa môi trường riêng, có thể chung một bình chứa nhưng có hai ngăn khác nhau hay gồm một hệ thống bình chứa nối với hệ thống chứa mẫu cấy bằng hệ thống ống dẫn và bơm điều khiển.
Phân loại hệ thống nuôi cấy ngập tạm thời
Hệ thống ngập sử dụng trong vi nhân giống thực vật được mô tả và phân loại theo 4 nhóm chính theo cách thức vận hành như sau: hệ thống nuôi cấy ngập nghiêng lắc, hệ thống ngập hoàn toàn có sự thay mới môi trường dinh dưỡng, hệ thống ngập một phần có sự thay mới môi trường dinh dưỡng, hệ thống ngập hoàn toàn trong đó môi trường dinh dưỡng được bơm nhu động vào khu vực nuôi cấy và không có sự thay mới môi trường. Các hệ thống ngập được phân loại dựa trên các yếu tố về kích thước bình nuôi cấy, loại giá đỡ, có hay không có sử dụng hệ thống máy vi tính để điều khiển hay chỉ đơn giản điều khiển bằng các máy hẹn giờ (timers), cách thức vận chuyển môi trường (sử dụng bơm nhu động, bơm khí hay di chuyển bình chứa).
Các kiểu hệ thống nuôi cấy ngập tạm thời thông dụng hiện nay
Hệ thống này cho phép toàn bộ mẫu tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng, kết hợp với sự làm mới bầu không khí trong bình nuôi cấy nhờ sử dụng bộ phận bơm khí có nhiệm vụ vừa cung cấp không khí vào môi trường, vừa có tác dụng đẩy chất lỏng ra vào bình nuôi cấy. Trong suốt thời gian mẫu cấy ngập trong môi trường lỏng, không khí được cung cấp vào bình nuôi cấy dưới dạng những bọt khí, môi trường được chuyển động làm cho mẫu cấy xoay trở được các mặt tiếp xúc với môi trường làm mới không gian nuôi cấy.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- Phương pháp nghiên cứu 1. Cách pha môi trường
Nhưng đáng tiếc là hiệu quả tác dụng của các loại dịch chiết dinh dưỡng này lờn sự tăng trưởng của phụi vẫn chưa được biết rừ, cú thể trong thành phần các dịch chiết này chứa một số hợp chất kích thích tăng trưởng giúp cho sự phát triển bình thường của phôi. Chồi nuôi cấy: gồm các chồi in vitro của hai giống lan Hồ điệp (Phalaenopsis Yubidan) và lan Dendrobium Sonia 12 tuần tuổi của phòng Công nghệ Sinh học - Viện khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam, được tạo từ các PLB naêm 2008.
KẾT QUẢ – THẢO LUẬN
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ khoáng đa lượng đến sự hình thành và phát triển của chồi lan Phalaenopsis Yubidan
Tuy nhiên số chồi đạt được vẫn thấp hơn so với nghiên cứu của Hempfling Tino và Preil Walter (2005) là do tác giả sử dụng hệ thống nuôi cấy ngập tạm thời kiểu bình sinh đôi loại 5 lít để nhân chồi giống Phalaenopsis cv.Jaunina trên mụi trường MS ẵ cú bổ sung TDZ 0.5 mg/l cho tỷ lệ nhõn chồi là 25.4 sau 12 tuần nuôi cấy. Tỷ lệ nhân chồi của đề tài thấp hơn nhiều, sự khác biệt này là do: hệ thống nuôi cấy của Hempfling rộng hơn đã tạo không gian tốt cho khả năng nhân chồi; hoặc do thời gian nuôi cấy của Hempfling dài hơn; cũng có thể là do sự bổ sung chất điều hòa sinh trưởng khác với đề tài (sử dụng BA, NAA); hay có thể do thí nghiệm thực hiện trên 2 giống lan Hồ điệp khác nhau;.
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ khoáng đa lượng đến sự hình thành và phát triển của chồi lan Dendrobium Sonia
Song nếu thay đổi nồng độ khoáng đa lượng trong môi trường MS theo hướng tăng dần như mụi trường S3 (ẳ KĐL trong 4 tuần đầu và ẵ KĐL cho 4 tuần sau) và mụi trường S6 (0 KĐL trong 2 tuần đầu, ẳ KĐL tuần thứ 4, ẵ KĐL tuần thứ 6 và 1 KĐL tuần thứ 8) cho thấy khả năng tạo chồi lại thấp. Tuy nhiên xét về sự tạo chồi ổn định qua các giai đoạn nuôi (bảng 3.3) và chất lượng của chồi sau sau 8 tuần nuôi (bảng 3.4) thì chỉ có môi trường S1 là thỏa mãn với yêu cầu chất lượng đó là: chồi phát triển mạnh, chồi lớn, đồng đều, trung bình 1 chồi có 3 – 4 lá, lá có màu xanh đậm, không thấy xuất hiện rễ.
