Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sản xuất protease kiềm từ đất vườn

Protease

Vi sinh vật đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ môi trường vì chúng tham gia vào quá trình phân hủy các chất trong vòng tuần hoàn vật chất. Nhờ có các loại vi sinh vật trong đó có vi khuần Bacillus mà các rác thải được thải ra do hoạt động sống của con người sẽ được phân hủy.

Sơ lược lịch sử nghiên cứu enzim [9], [34], [35]

Ông thấy rằng các phần khác nhau của cây đu đủ có protease, khi dùng cồn kết tủa sẽ nhận được chế phẩm không tinh khiết (100g/cây) gọi là papain. Trong khi đó các protease của vi sinh vật chỉ được chú ý nghiên cứu từ năm 1950, mặc dù từ năm 1918-1919, Waksman đã phát hiện được khả năng phân giải protein của xạ khuẩn.

Phân loại và các đặc điểm của protease [9], [12], [17]

Nhóm này thường hoạt động mạnh ở vùng pH là axit, bị ức chế bởi diazoacetyl norleucine methyl ester (DNME) và có tính đặc hiệu đối với các axit amin có vòng thơm hoặc axit amin kị nước ở cả hai phía của liên kết peptit bị thủy phân. Tuy nhiên, tác động tối ưu của protease còn phụ thuộc vào bản chất của cơ chất vì cùng một loại protease của một chủng vi khuẩn, khi thủy phân casein, hemiglobin, gelatin sẽ thể hiện hoạt độ cực đại ở những giá trị pH khác nhau.

• Vật liệu 1. Thiết bị

Các dung dịch

• Một số phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn
• Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên khả năng sinh trưởng và tạo enzym của các chủng vi khuẩn

Cách tiến hành: Lấy một phiến kính khô và sạch đặt lên giá đở, nhỏ một giọt nước sạch vô trùng lên phiến kính, dùng que cấy lấy một ít vi sinh vật trên môi trường đặc, đặt vào chổ phiến kính, hòa nhẹ để tạo dịch huyền phù. Ta cũng có thể tiến hành nhuộm bào tử theo phương pháp sau: Cố định mẩu trên phiến kính sau đó nhỏ lên mẩu thuốc nhuộm xanh metylen hơ nóng trong 3 phút ( chú ý không để mẩu bị khô nếu khô phải nhỏ thêm). Đánh giá khả năng tạo thành enzym để tuyển chọn những giống có hoạt tính enzym cao: Lật sấp đĩa petri dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D), và đo đường kính của giếng (d).

 Nguyên tắc hoá học (phương pháp Maxam và Gilbert): dựa vào các phản ứng thuỷ giải hoá học đặc hiệu phân tử DNA, tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước chênh nhau 1 nucleoide. Sau 40h nuôi cấy tiến hành chiết tách protease ngoại bào ở vi khuẩn bằng cách: Ly tâm dịch môi trường ở 5000vòng/ phút trong 20 phút để thu dịch chiết protease ngoại bào (loại bỏ cặn ở dưới). Phương pháp tách và thu nhận enzym protease bằng dung môi hữu cơ Tiến hành tủa với các tác nhân tủa: ethanol 960, acetone, muối sunfatamon bão hòa, ở nồng độ thích hợp, thời gian tủa tùy theo tác nhân tủa, thường trong khoảng 30-45phút, đối với ethanol và acetone quá trình tủa phải đảm bảo ở nhiệt độ lạnh.

Lấy chế phẩm protease thu được cho tác động với cơ chất casein được pha trong các dung dịch đệm có độ pH khác nhau 6, 6.5, 7, 7,5 , 8..Xác định hoạt tính protease của chế phẩm theo phương pháp Anson. Phương pháp xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ protease Xác định hoạt độ protease của chế phẩm theo phương pháp Anson ở những nhiệt độ khác nhau trong dãy nhiệt độ 350C, .., 800C.

Phân lập và tuyển chọn 1. Phân lập

• Xác định các đặc điểm sinh học 1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc

Tiến hành pha loảng chủng KT 10, 6, 8 với nồng độ thích hợp với nước cất, tiến hành cấy dàn trên đĩa petri và quan sát khuẩn lạc của chúng dưới kính hiển vi với độ phóng đại 40 lần. Qua quan sát hình 3.3 ta thấy tế bào của cả ba chủng đều bắt màu tím có dạng hình que chứng tỏ cả ba đều là vi khuẩn gram dương. Sau đó gạt dịch này lên bề mặt môi trường thạch đĩa, để ở 370C trong 24 giờ theo dừi thấy cả 3 chủng đều cú xuất hiện khuẩn lạc, chứng tỏ cả ba chủng đều sinh bào tử.

Chúng tôi tiến hành quan sát các mẩu nhuộm đơn dưới kính hiển vi có độ phóng đại 1000 lần ta thấy bào tử của cả 3 chủng phân bố chính tâm là chủ yếu. Chính vì vậy trong quá trình nghiên cứu tiếp theo cần sử dụng máy lắc: bình tam giác 250ml chứa 50ml dịch môi trường được bổ sung 1-2% chủng giống được lắc ở 200vòng/. Việc nghiên cứu khả năng chịu mặn của các chủng vi khuẩn có ý nghĩa rất lớn tới phạm vi ứng dụng của vi khuẩn như sản suất chế phẩm probiotic để nuôi tôm.

Để có thể đánh giá chính xác chúng tôi tiến hành lên men 3 chủng vi khuẩn trên trong môi trường 2.2.3 lỏng và tiến hành đo hoạt độ của 3 chủng trên theo phương pháp Anson. Tiến hành nuôi các chủng trên trong môi trường có casein 1% trong điều kiện 370C trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/ phút trong 48 tiếng.

Phân loại và xác định tên của chủng tuyển chọn

Theo bảng 3.4 ta thấy chủng số 10 có hoạt tính protease và tốc độ sinh trưởng cao nhất. Nên ta chọn chủng KT 10 để tiến hành nghiên cứu các đặc điểm sinh trưởng và phát triển tiếp theo. Trình tự này được đem đối chiếu với trình tự 16S rARN của các chủng vi khuẩn đã được định loại trong ngân hàng gen BLAST.

Kết quả đối chiếu cho thấy chủng KT 10 là Bacillus subtilis với độ chính xác là 100%. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và.

Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và tổng hợp protease của vi khuẩn

Trong đó môi trường đậu nành 4% và casein 3% vi khuẩn phát triển tốt nhất và cho hoạt độ enzim cao nhất. Tuy nhiên, do giá thành của bột đậu nành rẻ hơn, lại dể tìm nên ta chọn đậu nành là cơ chất cảm ứng sinh enzim sau này. Đo OD sinh trưởng và hoạt tính protease của vi khuẩn ta thu được kết quả theo bảng sau.

Qua đồ thị ta thấy nồng độ CaCO3 thích hợp nhất cho sự sinh trưởng và sinh enzim protease của vi khuẩn là 0.5%. Nên trong các thí nghiệm sau ta chọn môi trường có nồng độ cơ chất đậu nành là 4% và bổ sung CaCO3 với nồng độ là 0.5%.

Nghiên cứu các điều kiện môi trường ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzym prorease của vi khuẩn

Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym protease của chủng vi khuẩn KT 10. Nhiều nghiên cứu cho thấy nhờ khả năng sinh bào tử mà các vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh trưởng trong giới hạn nhiệt độ khá rộng, nhưng hầu hết các vi khuẩn nhóm này đều là loài ưa ấm với nhiệt độ dao động từ 20 – 450C [21,22]. Theo số liệu ở bảng 3.9 ta thấy sự sinh trưởng và hoạt độ protease của vi khuẩn KT 10 đạt tối đa ở điều kiện nhiệt độ là 370C.

Kết quả này là phù hợp vì các chủng Bacillus thường là các chủng ưa ấm.Vì vậy, trong các thí nghiệm tiếp theo ta chọn điều kiện nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 370C. Do vậy, trong các thí nghiệm tiếp theo ta chọn độ pH thích hợp cho sự sinh trưởng và sinh enzim của vi khuẩn là 7-7.5. Nồng độ oxi hòa tan trong môi trường có ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh trưởng phát triển của vi sinh vật hiếu khí.

Tuy nhiên ảnh hưởng này có khác nhau tùy theo từng loài vi khuẩn, hầu hết là làm tăng tốc độ sinh trưởng, rút ngắn pha tiềm phát, nâng cao lượng sinh khối nhưng trong một vài trường hợp thì thiếu oxi tuy có kiềm hãm sinh trưởng nhưng lại gia tăng quá trình sinh tổng hợp enzim. Để tìm hiểu ảnh hưởng của độ thông khí lên khả năng sinh enzim và sinh trưởng của vi khuẩn ta cho vào các bình tam giác có thể tích 250ml dung địch lên men có thể tích khác nhau từ 25ml – 125ml.