Quy trình sản xuất vắc-xin nhị giá phòng bệnh dịch tả vịt và viêm gan virus ở vịt

Mục ủớch nghiờn cứu ủề tài

- Nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin nhị giá dịch tả vịt và viêm gan vịt.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Kết quả khảo sỏt một số ủặc tớnh sinh học của hai giống gốc virus nhược ủộc viờm gan vịt DH-EG-2000 và dịch tả vịt DP-EG-2000

Sau khi gây nhiễm virus vào phôi, 100% số phôi bị chết trong khoảng từ 25 - 96 giờ với những bệnh tớch ủặc trưng: Phụi bị xuất huyết trờn da, ủặc biệt là vựng ủầu, lưng và ủựi; phụi cú hiện tượng phự rừ. Số phụi chết thường tập trung trong khoảng 73 - 96 giờ sau khi gõy nhiễm chứng tỏ tớnh ổn ủịnh của chủng virus này trờn phụi gà. Kết quả kiểm tra bệnh tớch ủại thể trờn phụi sau khi gõy nhiễm virus nhược ủộc viờm gan vịt DH - EG – 2000 ủược chỳng tụi trỡnh bày ở bảng 4.2.

Tất cả các phôi có bệnh tớch ủều cũi cọc và cú kớch thước nhỏ hơn rất nhiều so với cỏc phụi ủối chứng không gây nhiễm virus. Quan sỏt tiờu bản vi thể tổ chức gan của những phụi ủó gõy nhiễm virus. 49 thấy: Cấu trỳc gan bị biến ủổi; cú hiện tượng xuất huyết lan tràn trong nhu mụ gan, tế bào Lympho tăng sinh mạnh, một số tế bào gan bị thoái hoá mỡ và thoái hoá không bào.

Phôi gà nhiễm VR VGV-phôi xuất huyết, còi cọc;

50 Kết quả thu ủược ở bảng 3 cho thấy: Chủng virus vacxin nhược ủộc dịch tả vịt DP-EG-2000 cũng cú tớnh thớch ứng cao và ổn ủịnh trờn phụi gà 9 ngày tuổi. Tớnh thớch ứng ủú biểu hiện ở sự nhõn lờn của virus trong phụi, gõy chết phụi ở từng thời ủiểm tương ủối ổn ủịnh và số phụi chết tập trung ở khoảng thời gian từ 49 - 72 giờ. Kiểm tra bệnh tớch ủại thể trờn phụi sau khi gõy nhiễm virus nhược ủộc dịch tả vịt DP-EG-2000 ủược trỡnh bày ở bảng 4.4.

Kết quả kiểm tra bệnh tớch ủại thể trờn phụi sau khi gõy nhiễm virus nhược ủộc dịch tả vịt DP-EG-2000.

Phụi gà ủối chứng

Tất cả cỏc phụi cú bệnh tớch ủều xuất huyết trờn da và cú kớch thước nhỏ hơn rất nhiều so với cỏc phụi ủối chứng không gây nhiễm virus.

Phôi gà xuất huyết, còi cọc, gan phôi gà sưng, xuất huyết

52 một thời gian vận chuyển từ nước ngoài về Việt Nam và qua quá trình bảo quản vẫn giữ ủược tớnh ổn ủịnh về ủộc lực và khả năng thớch nghi cao trờn phôi gà. Kết quả xỏc ủịnh chỉ số ELD50, EID50 của hai chủng virus viờm gan vịt và dịch tả vịt. Bên cạnh việc kiểm tra khả năng thích ứng của 2 chủng virus nhược ủộc viờm gan vịt và dịch tả vịt trờn phụi gà, chỳng tụi cũng tiến hành xỏc ủịnh 2 chỉ số ELD50 và EID50 trờn phụi gà 9 ngày tuổi.

Kết quả xỏc ủịnh chỉ số ELD50 của chủng virus vacxin nhược ủộc dịch tả vịt DP-EG-2000. Kết quả xỏc ủịnh chỉ số ELD50 của chủng virus vacxin nhược ủộc viờm gan vịt DH-EG-2000. Song song với việc xỏc ủịnh liều gõy chết 50% ủộng vật thớ nghiệm (ELD50) , chỳng tụi cũng tiến hành xỏc ủịnh liều gõy nhiễm 50% ủộng vật thớ nghiệm (EID50).

Kết quả xỏc ủịnh chỉ số EID50 của chủng virus vacxin nhược ủộc dịch tả vịt DP-EG-2000. Như vậy, sau khi kiểm tra cỏc ủặc tớnh sinh học của 2 chủng virus dịch tả vịt DP-EG-2000 và viêm gan vịt DH- EG-2000 chúng tôi thấy 2 chủng này hoàn toàn ủỏp ứng ủược tiờu chuẩn của một chủng virus vacxin nhược ủộc dịch tả vịt. Cú thể sử dụng chỳng ủể sản xuất vacxin nhược ủộc phũng bệnh dịch tả vịt cho ủàn vịt ở Việt Nam.

Chỳng tụi sử dụng cặp mồi ủược thiết kế theo trỡnh tự ủó ủược OIE cung cấp ủể thiết lập phản ứng Realtime PCR với thuốc nhuộm SYBR Green xỏc ủịnh virus nhược ủộc chủng DP-EG-2000 ủỳng là virus dịch tả vịt. SYBR Green chỉ phúng thớch một lượng nhờ tớn hiệu huỳnh quang khi nú ở dạng tự do trong dung dịch, nhưng tín hiệu huỳnh quang sẽ tăng lên 1000 lần khi nú liờn kết DNA mạch ủụi. Như vậy, tớn hiệu huỳnh quang tổng từ phản ứng sẽ tỷ lệ với lượng DNA mạch ủụi hiện diện, và gia tăng trỡnh tự mục tiờu ủược khuếch ủại.

Phõn tớch melt-curve ủược dựng ủể nhận diện cỏc sản phẩm phản ứng khỏc nhau, bao gồm cả sản phẩm khụng ủặc hiệu. Sau khi phản ứng khuếch ủại hoàn tất, một phõn tớch melt-curve ủược tiến hành bằng cỏch gia tăng nhiệt ủộ từng bước và kiểm soỏt tớn hiệu huỳnh quang tại mỗi bước. Tại nhiệt ủộ núng chảy của sản phẩm khuếch ủại (Tm, nhiệt ủộ mà tại ủú 50% cặp base của một DNA mạch ủụi bị tỏch ra) xuất hiện một ủỉnh ủặc trưng phõn biệt nú với sản phẩm khỏc như primer-dimer, vốn núng chảy ở nhiệt ủộ khỏc.

Kết quả chạy ủiện di sản phẩm RT-PCR của mấu VxXT và VxAC trên thạch agarose 1%

Như vậy, cú thể kết luận rằng chỳng tụi ủó xỏc ủịnh ủược vựng gen VP1 của hệ gen virus viờm gan vịt, virus nhược ủộc chủng DH-EG-2000 chớnh là virus viêm gan vịt. Chỳng tụi tiến hành sản xuất hai loại vacxin ủơn giỏ dịch tả vịt, viờm gan vịt theo quy trỡnh ủược trỡnh bày trong phần phương phỏp nghiờn cứu và kiểm tra chỉ tiêu vô trùng của hai loại vacxin trên. Như vậy hai loại vacxin nhược ủộc dịch tả vịt sản xuất từ chủng virus nhược ủộc DP-EG- 2000 và vacxin viờm gan vịt sản xuất từ chủng virus nhược ủộc DH - EG - 2000 trờn phụi gà là hoàn toàn thuần khiết, ủạt chỉ tiờu vụ trựng của vacxin.

Chúng tôi tiến hành sản xuất thử nghiệm 3 lô vacxin nhị giá dịch tả vịt, viờm gan vịt và tiếp tục kiểm tra chỉ tiờu vụ trựng, ủồng thời tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu an toàn, hiệu lực của vacxin nhị giá dịch tả vịt và viêm gan vịt tại phòng thí nghiệm. Như vậy, vacxin DHP chế từ 2 chủng virus vacxin nhược ủộc viờm gan vịt DH-EG-2000 và dịch tả vịt DP-EG-2000 trên phôi gà là hoàn toàn thuần khiết, ủạt chỉ tiờu vụ trựng của vacxin. Sau kết quả kiểm tra trong phòng thí nghiệm nếu vacxin an toàn, chúng tụi tiến hành thử nghiệm với ủàn vịt nuụi tại ủịa phương, tiến hành tiờm cho 4 ựàn vịt ở các ựịa ựiểm khác nhau Văn Lâm- Hưng Yên, đông Anh- Hà Nội, Gia Lõm-Hà Nội, Ân Thi-Hưng Yờn và ở cỏc ủộ tuổi khỏc nhau: 1 ngày tuổi, 5 ngày tuổi, 50 ngày tuổi, 240 ngày tuổi với liều tiêm 0,5ml/con.

- Lần thứ nhất: 20 vịt thớ nghiệm sau 21 ngày cụng cường ủộc ủợt 1 cả 20 con ủều sống sút, tỷ lệ bảo hộ ủạt 100%; 10 vịt khụng ủược tiờm vacxin sau khi cụng cường ủộc ủều chết với triệu chứng và bệnh tớch ủặc trưng của bệnh: liệt cánh, liệt chân, tiêu chảy phân xanh, vịt có bệnh tích viêm kết mạc mắt, xuất huyết dưới da, ruột non xuất huyết thành những vũng nhẫn; tỷ lệ chết 100%. Như vậy, vacxin nhị giỏ viờm gan vịt và dịch tả vịt ủược sản xuất từ hai chủng virus nhược ủộc viờm gan vịt DH-EG-2000 và dịch tả vịt DP-EG-2000 gõy ủỏp ứng miễn dịch tốt. Tóm lại, kết quả kiểm tra các chỉ tiêu: vô trùng, an toàn, hiệu lực của vacxin nhị giỏ viờm gan vịt và dịch tả vịt ủạt ủược cỏc chỉ tiờu tiờu chuẩn của một vacxin.

Vacxin DHP sau khi sản xuất, kiểm nghiệm cho kết quả tốt, chúng tôi dựng vacxin này ứng dụng vào thực tế sản xuất nhằm mục ủớch khống chế bệnh dịch tả vịt và viêm gan vịt. Chỳng tụi tiến hành tiờm phũng vacxin DHP cho một số ủàn vịt nuụi tại cỏc cơ sở cú bệnh Dịch tả vịt và Viờm gan vịt lưu hành, ủồng thời tiến hành theo dừi ủàn khụng ủược tiờm vacxin trong cựng một ủịa phương xảy ra dịch. 73 Qua kết quả bảng 4.15 cho thấy chỳng tụi ủó tiến hành tiờm phũng ủược 3 ủàn vịt tại cỏc ủịa ủiểm Ân Thi-Hưng Yờn, Gia Lõm-Hà Nội, Văn Lõm-Hưng Yờn với tổng số lượng 750 con.

Qua bảng 4.16 chỳng tụi thấy, sau khi tiờm vacxin DHP cho ủàn vịt bố mẹ, vịt con ủó cú ủược khỏng thể thụ ủộng do mẹ truyền sang qua lũng ủỏ trứng, có thể bảo hộ cho vịt con qua lứa tuổi cảm nhiễm (1-21 ngày tuổi), tăng khả năng phũng vệ cho ủàn vịt con chống lại hai bệnh DTV-VGV với tỷ lệ bảo hộ từ 95-100%, trong khi ủàn vịt ủối chứng khụng ủược tiờm vacxin, tỷ lệ bảo hộ cao nhất chỉ ủạt 10%. Hai chủng virus vacxin nhược ủộc viờm gan vịt DH-EG-2000 và dịch tả vịt DP-EG-2000 ủược bảo quản tốt và khụng bị thay ủổi cỏc chỉ tiờu về ủặc tớnh sinh học và khả năng thớch ứng trờn phụi gà. Tiêm phòng vacxin nhị giá DHP cho vịt bố mẹ tạo miễn dịch thụ ủộng cho vịt con qua thử nghiệm thấy vacxin nhị giỏ DHPV cung cấp sự bảo hộ ủầy ủủ chống lại nguy cơ nhiễm virus cường ủộc của cả 2 bệnh, giống như từng vacxin ủơn giỏ ủó bảo hộ với nguy cơ nhiễm virus của mỗi bệnh.