Xác định hoạt chất trong thuốc kháng sinh β-lactam W 10, E41 bằng phương pháp phổ hồng ngoại

Phương pháp đo quang

Phương pháp đo quang là phương pháp phân tích dựa trên tính chất quang học của chất cần phân tích như tính hấp thụ quang, tính phát quang…Các phương pháp này đơn giản, dễ tiến hành, thông dụng, được ứng dụng nhiều khi xác định β-lactam, đặc biệt trong dược phẩm [8 ]. Tuy nhiên, nếu không kết hợp với phương pháp chiết pha rắn mắc nối tiếp, các phương pháp quang học chủ yếu chỉ dùng xác định riêng rẽ từng chất kháng sinh và trong các đối tượng có nhiều yếu tố ảnh hưởng hay chất tương tự chất phân tích việc xác định sẽ kém chính xác.

Các phương pháp sắc ký

Mục đích của nghiên cứu này nhằm phát triển một phương pháp phân tích mới đơn giản và nhanh chóng để xác định và định lượng mười bốn kháng sinh từ các mẫu sữa khác nhau.Trong đó, có năm β-lactam, bốn sulfonamides, ba tetracycline, một macrolid và một cephalosporin. Agence Franỗaise de Sộcuritộ Sanitaire des Aliments cựng cỏc cộng sự [19] đó sử dụng phương pháp HPLC để xác định 8 hợp chất penicillin (benzylpenicillin, phenoxymethylpenicillin, ampicillin, amoxicillin, nafcillin, oxacillin, cloxacillin, và dicloxacillin) ở mức lượng vết trong các mô cơ.

Phương pháp phổ hồng ngoại

Cho dung dịch và dung môi nguyên chất vào hai cuvet có bề dày 0,1-1,0 mm và bằng việc so sánh hai chùm tia đi qua dung dịch và dung môi có thể loại được vân hấp thu của dung môi.Kỹ thuật thường sử dụng cho các chất lỏng có độ nhớt thấp và dễ bay hơi.Dung môi không được phép hấp thụ quá 65% bức xạ chiếu vào vì cường độ bức xạ còn lại sẽ quá yếu. Trong thực tế, để phân tích các chất hữu cơ phức tạp, người ta thường sử dụng máy hồng ngoại được ghép với máy sắc kí khí.Trong hệ thống sắc kí khí-hồng ngoại (GC/IR), sau khi được tách bằng máy sắc kí khí, mỗi hợp phần đi ra từ cột sắc kí (tương ứng với mỗi pic trên sắc kí đồ) sẽ được ghi phổ hồng ngoại (thường dùng FTIR) và được lưu giữ trong bộ nhớ của máy tính.

Kỹ thuật đo hồng ngoại định lượng một hoạt chất trong thuốc

Do vậy, dựa vào phương trình này có thể xác định được hàm lượng của một chất trong hỗn hợp và độ chuyển hóa của một phản ứng dựa vào cường độ của một đỉnh píc đặc trưng cho nhóm chức có trong chất đó.

Các ứng dụng của phổ hồng ngoại kết hợp với Chemometric để định lượng thuốc kháng sinh β – lactam

Phương pháp này được đánh giá có nhiều ưu điểm như không tốn dung môi, không cần phá mẫu mà vẫn phân tích trực tiếp được các mẫu rắn, giá thành phân tích thấp phù hợp kiểm định nhanh các loại thuốc đang lưu hành trên thị trường hiện nay. Các sản phẩm vô định hình được sản xuất từ quy trình sản xuất khác nhau đã tạo ra các loại thuốc đa hình thường có tính chất vật lí, hóa học khác nhau.Phương pháp phổ hồng ngoại gần kết hợp với phương pháp Chemometric đa biến được xem là công cụ hữu hiệu cho việc xác định các tinh thể trong việc lựa chọn các dãy quang phổ tối ưu tương ứng với dạng tinh thể đặc trưng với thành phần đặc trưng. Như vậy thực tế phân tích cho thấy, các phương pháp truyền thống như HPLC, phương pháp quang học hay phương pháp phổ hồng ngoại thường chỉ được dùng để xác định các hoạt chất ở dạng riêng rẽ, không thể dùng xác định đồng thời đồng thời các hoạt chất có cấu trúc phân tử gần giống nhau trong cùng nhóm có trong cùng mẫu thuốc.

Khảo sát các điều kiện đo phổ hồng ngoại xác định đồng thời Penicillin và Cephalexin trong cùng hỗn hợp

Tá dược là chất phụ gia thường được thêm vào ổn định dạng thuốc, mỗi loại tá dược đều có đặc tính và vai trò khác nhau, là yếu tố không thể thiếu trong các công thức thuốc và trong mỗi công thức thuốc thì thành phần tá dược cũng thay đổi cùng với các nhà sản xuất. Do đó không thể dùng phương pháp định lượng thông thường dựa trên mối quan hệ giữa độ hấp thụ quang và nồng độ để định lượng các hoạt chất mà phải sử dụng phương pháp phổ hồng ngoại kết hợp với chemometrics trên cơ sở sử dụng ma trận hệ số tương quan từ phổ toàn phần để định lượng được đồng thời hai hoạt chất này trong hỗn hợp với các tá dược. Từ kết quả bảng 3.5 có thể nhận thấy độ hấp thụ quang hay diện tích píc thay đổi sau mỗi lần ép viên với cùng lượng mẫu ban đầu, do đó không thể dùng phương pháp định lượng thông thường dựa trên mối quan hệ tuyến tính giữa độ hấp thụ quang và nồng độ để định lượng chất phân tích.

Xây dựng mô hình hồi qui đa biến tuyến tính phân tích hoạt chất Penicillin 1. Mô hình đường chuẩn đa biến xác định hoạt chất Penicillin khi có chứa tá

Sau khi đo độ hấp thụ quang của các mẫu chuẩn, các kết quả đo được trình bày ở dạng ma trận tín hiệu đo (23x51), trong đó độ hấp thụ quang Ađược đo tại 51 số sóng(Phụ lục 2-(mục Penicillin)).Sau đó các dữ liệu ma trận hàm lượng và ma trận tín hiệu đo được chuyển vào phần mềm Matlab tính theo phương pháp hồi quy đa biến PCR để tìm số PC phù hợp và các ma trận trị riêng, vectơ riêng của mô hình (phụ lục số 2). Trong số các phương pháp hồi qui đa biến tuyến tính như bình phương tối thiểu cổ điển (CLS), bình phương tối thiểu nghịch đảo (ILS), bình phương tối thiểu riêng phần (PLS), thì công trình nghiên cứu [6] trên cùng phương pháp phân tích phổ hồng ngoại gần cho thấy cả ba phương pháp này đều cho kết quả sai số lớn hơn nhiều so với phương pháp PCR. Để kiểm chứng tính phù hợp của phương pháp hồi quy đa biến, chúng tôi chuẩn bị 12 mẫu chuẩn, có hàm lượng các cấu tử nằm trong khoảng đường chuẩn đã xây dựng, mỗi mẫu chuẩn có chứa hai cấu tử gồm Penicillin và tá dược (gồm hai loại tá dược tinh bột và tacl) .Ma trận mẫu kiểm tra này có kích thước (12x2).

Xây dựng mô hình hồi qui đa biến tuyến tính phân tích hoạt chất Cephalexin 1. Mô hình đường chuẩn đa biến xác định hoạt chất Cephalexin khi có chứa tá

Từ kết quả sai số thu được ở bảng số liệu bảng 3.8 cho thấy mô hình PCR là phù hợp (giá trị sai số nằm trong giới hạn cho phép) khi xác định đồng thời hoạt chất PEN và tá dược.Do đó có thể dùng mô hình này để xác định đồng thời hàm lượng các hoạt chất và. Sau khi đo độ hấp thụ quang của các mẫu chuẩn, các kết quả đo được trình bày ở dạng ma trận tín hiệu đo (23x 101), trong đó độ hấp thụ quang A được đo tại 101 bước sóng (Phần phụ lục 2-(mục Cephalexin)).Các dữ liệu các ma trận hàm lượng và ma trận tín hiệu đonày được chuyển vào phần mềm Matlab tính toán theo phương pháp hồi quy đa biến PCR để tìm số PC phù hợp, và các ma trận trị riêng, vectơ riêng của mô hình (phụ lục số 2). Thực hiện chuyển ma trận tín hiệu độ hấp thụ quang của 20 mẫu tại 101 số sóng vào trong phần mềm Minitab16, sau đó dùng phương pháp PCA cho hai tập số liệu A và C để tìm các biến ảo (PC) có trị số P (score- giá trị eigenvector) và trọng số Q (loading).

Xây dựng mô hình hồi qui đa biến tuyến tính phân tích đồng thời hoạt chất Penicillin và Cephalexin trong cùng hỗn hợp

• Định lượng mẫu thực tế 1. Xử lý mẫu sơ bộ

Nhập các kết quả của hai mai trậnhàm lượng chuẩn và ma trận hàm lượng đánh giá cùng với các ma trận tín hiệu đo vào trong phần mềm matlab, tính toán theo phương pháp hồi qui cấu tử chính PCR ta thu được bảng kết quả hàm lượng của Penicillin, Cephalexin, tinh bột và Magie stearat trong cùng hỗn hợp (bảng 3.14). Từ bảng số liệu trên cho ta thấy khi xác định đồng thời các cấu tử Penicillin, Cephalexin, tinh bột và Magie stearat trong cùng hỗn hợp phương pháp hồi qui cấu tử chính (PCR) cho kết quả sai số tương đối nhỏ (trong khoảng sai số cho phép) và kết quả sai số được lưu trong mục hỗn hợp cephalexin và penicillin – phụ lục 2, hàm lượng các cấu tử thu được sai khác không nhiều so với hàm lượng cấu tử ban đầu. Sau đó tiến hành xây dựng thư viện phổ của hai mẫu tự tạo có chứa hai hoạt chất nghiên cứu penicillin và cephalexin.Tiến hành bằng cách lấy 3mg mẫu tự tạo 1 trong ở mục 3.2.1 có thành phần gồm penicllin với hai loại tá dược tal và tinh bột; mẫu tự tạo 2 trong mục 3.3.1 gồm cephalexin với hai loại tá dược tinh bột và magie stearat, trộn và nghiền đều với bột KBr theo tỷ lệ 3:97 trên cối mã não, lấy khoảng 15mg mẫu vừa trộncho vào bộ dụng cụ ép viên, quét phổ các mẫu tự tạo trong vùng từ 4000- 2800 cm-1, thu được hình ảnh phổ tương ứng với các mẫu tự tạo, lưu dạng phổ vừa đo vào trong phần mềm thu được thư viện viện của phổ nhóm penicillin và cephalexin, bảng dữ liệu so sánh được chỉ ra.