Nghiên cứu sản xuất enzyme protease từ nấm sợi ở rừng ngập mặn Cần Giờ

Nuôi cấy bề mặt

Nguyên tố photpho tham gia vào cấu tạo của nhiều chất hữu cơ quan trọng trong tế bào NS: nucleotit, nucleoprotein….Photpho còn có mặt trong nhiều coenzyme quan trọng như ADP, ATP, NAD, FAD…. + Ưu điểm: chế phẩm dễ dàng sấy khô mà không làm giảm đáng kể hoạt tính enzyme, chế phẩm khô, dễ bảo quản, vận chuyển, nghiền nhỏ hoặc sử dụng trực tiếp nếu không cần khâu tách và làm sạch enzyme.

Nuôi cấy chìm

Nuôi cấy trong điều kiện vô trùng tuyệt đối và trong quá trình nuôi cấy nếu có nhiễm trùng phần nào, khu vực nào thì chỉ cần loại bỏ canh trường phần đó. + Nhược điểm: phương pháp bề mặt có năng suất thấp, khó cơ khí hóa, tự động hóa, cần diện tích nuôi lớn, chất lượng chế phẩm ở các mẻ không đồng đều.

Thu nhận protease

Có thể bổ sung thêm nguồn N vô cơ, N hữu cơ và các chất kích thích ST như malt, nước chiết ngô, nước lọc bã rượu. Thiết bị, dụng cụ nuôi cấy đơn giản, có thể thực hiện qui mô gia đình, trang trại cũng như ở qui mô lớn.

Phân lập và tuyển chọn

Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Khưu Phương Yến Anh khi nghiên cứu khu hệ NS ở RNM Cần Giờ (2007) và Mai Thị Hằng khi nghiên cứu khu hệ NS ở Nam Định, Thái Bình (2002). Để đánh giá sơ bộ khả năng sinh protease của NS ở RNM Cần Giờ chúng tôi tiến hành tuyển chọn các chủng NS có hoạt tính protease theo phương pháp 2.5.7. Điều đó chứng tỏ rằng ngoài nguồn cơ chất phổ biến là cellulose thì nguồn cơ chất protein ở RNM cũng khá phong phú, đó là xác của các ĐV thủy sinh, kể cả lá cây khi phân hủy cũng trở thành nguồn protein dồi dào cho NS.

Từ kết quả này cộng với cỏc cụng trỡnh nghiờn cứu của Nguyễn Thị Lan Hương, Vừ Thị Bớch Viên (2009), Khưu Phương Yến Anh (2007) chứng tỏ NS là tác nhân tích cực phân giải các cơ chất tinh bột, xelluloza, protein ở RNM Cần Giờ. Từ kết quả trên cho thấy số chủng NS có khả năng sinh protease khá nhiều, nhưng đa số có hoạt tính protease trung bình và yếu, chỉ có một số ít chủng có hoạt tính protease rất mạnh và mạnh (6%). Trên các nguồn cơ chất khác nhau, khả năng sinh protease cũng khác nhau do khả năng sinh enzyme này phụ thuộc rất nhiều vào chất cảm ứng protein.

Nguồn cơ chất lá vàng có số chủng sinh protease thấp nhất do đây không phải là nguồn cơ chất phù hợp cho sinh tổng hợp protease của NS. Để đánh giá chính xác khả năng sinh protease của các chủng NS tuyển chọn, chúng tôi tiến hành xác định hoạt độ protease theo phương pháp 2.5.7 của 10 chủng NS có đường kính vòng phân giải lớn nhất.

Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện MT đến ST và hoạt độ protease của hai chủng NS tuyển chọn

• Ảnh hưởng của độ mặn
• Ảnh hưởng của nguồn
• Ảnh hưởng của nhiệt độ
• Ảnh hưởng của độ ẩm

Ở MT có độ mặn 0%, hai chủng NS vẫn có khả năng ST khá tốt (chủng Penicillium paxilli đạt 5mm, chủng Paecilomyces lilacinus đạt 8mm), nhưng khả năng sinh protease rất thấp (hoạt độ protease của chủng Penicillium paxalli là 0.985 UI/ml, của chủng Paecilomyces lilacinus 0.690UI/ml). Kết quả nghiên cứu của Khưu Phương Yến Anh về cellulase (2007) và Nguyễn Thị Lan Hương và amylase (2007) đều xác định hoạt độ của các enzyme này mạnh nhất ở MT có độ mặn từ 1-3%. Nuôi cấy NS vào MT9 trong đó thay 5% bột ĐN bằng các nguồn N khác nhau: cao thịt, cao nấm men, casein, (NH4)2SO4 để tìm ra nguồn N tối ưu cho hoạt độ protease.

Tuy nhiên, trong thành phần dinh dưỡng của cám đã có 10-12.2% protein thô đóng vai trò là chất cảm ứng nên 2 chủng NS vẫn có khả năng sinh protease nhưng hoạt độ kém hơn hẳn ở MT có bổ sung nguồn N hữu cơ. Ở 20oC và 40oC, hai chủng NS đều ST rất yếu do nhiệt độ quá thấp hay quá cao làm ảnh hưởng đến nồng độ các chất hòa tan trong MT nuôi cấy và các phản ứng xúc tác trong tế bào NS, từ đó ức chế ST của chúng. Để xác định nhiệt độ nuôi cấy cho hoạt độ protease cao nhất, chúng tôi tiến hành nuôi cấy 2 chủng NS vào MT9, độ mặn 3%, hàm lượng bột ĐN 3% đối với chủng Paecilomyces lilacinus, 5%.

Như vậy, kết quả nghiên cứu trên cho thấy 2 chủng NS đều ST tốt và hoạt độ protease cao trong khoảng nhiệt độ từ 25oC -30oC, đây cũng là khoảng nhiệt độ trung bình ở RNM Cần Giờ. Chúng tôi tiến hành nuôi cấy 2 chủng NS vào MT9, độ mặn 3%, hàm lượng bột ĐN 3% đối với chủng Paecilomyces lilacinus, 5% đối với Penicillium paxilli. Điểm khác biệt của hai chủng này là ở pH =8, chủng Paecilomyces lilacinus vẫn có khả năng tổng hợp protease khá cao, trong khi đó, chủng Penicillium paxilli tổng hợp protease rất yếu.

Thời gian ST mạnh nhất của chủng Penicillium paxalli là từ ngày thứ 4 đến ngày thứ 5, đường kính vòng ST từ ngày 4 đến ngày 5 tăng 6,7mm, trong khi đó, từ ngày 1 đến ngày 4, sự tăng trưởng tương đối đồng đều, mỗi ngày đường kính vòng tăng trưởng tăng khoảng 4mm.

Nghiên cứu tách chiết protease bán tinh khiết từ dịch MT

Vòng phân giải casein của hai chủng NS với các tác nhân kết tủa khác nhau. Từ kết quả trên cho thấy trong ba tác nhân kết tủa trên, axeton là tác nhân kết tủa cho hoạt độ protease bán tinh khiết cao nhất ở cả hai chủng NS. Riêng ( NH4)2SO4 cho kết quả yếu hơn hẳn hai tác nhân kết tủa còn lại.

Như vậy, axeton là tác nhân kết tủa cho hoạt độ protease bán tinh khiết cao nhất đối với cả 2 chủng NS.

Một số đặc điểm sinh học khác của hai chủng NS

Vì vậy mà NS giữ một vai trò quan trọng trong HST ở RNM, chúng góp phần khép kín chu trình sinh địa hóa các chất trong HST.