Quy trình sản xuất sinh khối sợi nấm linh chi (ganoderma lucidum) phục vụ ứng dụng trong hỗ trợ điều trị bệnh lý

MỘT SỐ ỨNG DỤNG LÂM SÀN

Trị suy nhược thần kinh: Bệnh viện Hoa Sơn thuộc Viện Y học số 1 Thượng Hải báo cáo: Dùng cả 2 loại Linh chi nhân tạo và Linh chi hoang dại chế thành viên ( mỗi viên tương đương 1g thuốc sống), mỗi lần uống 3 viên, ngày 3 lần, một liệu trình từ 10 ngày đến 2 tháng. Trị chứng cholesterol máu cao: Báo cáo của Sở nghiên cứu kháng khuẩn tố công nghiệp Tứ Xuyên, dùng liên tục từ 1 đến 3 tháng cho 120 ca thuốc có tác dụng hạ cholesterol huyết thanh rừ rệt, tỷ lệ kết quả 86% ( theo bỏo cỏo đăng trờn bỏo thụng tin Trung thảo dược 1973,1:31). Trị viêm phế quản mạn tính: Tổ nghiên cứu Linh chi tỉnh Quảng Đông báo cáo dùng siro Linh chi và đường Linh chi, trị 1.110 ca có kết quả và có nhận xét là thuốc có tác dụng đối với thể hen và thể hư hàn ( theo tờ báo cáo tư liệu Y dược Quảng Đông 1979,1:1).

Trị viêm gan mạn tính: Tác giả dùng polysaccarit Linh chi chiết xuất từ Linh chi hoang dại chế thành thuốc bột hòa nước uống, trị các loại bệnh viêm gan mạn hoạt động, viêm gan mạn kéo dài và xơ gan gồm 367 ca, có nhận xét phần lớn triệu chứng chủ quan được cải thiện, men SGOT, SGPT giảm tỷ lệ 67,7% ( Tạp chí Bệnh gan mật 1985,4:242). Trị bệnh xơ cứng bì, viêm da cơ, bệnh liput ban đỏ, ban trọc: dùng Linh chi chế thành dịch, tiêm bắp và viên uống. Theo sách Trung dược ứng dụng lâm sàng: thuốc có tác dụng đối với bệnh loét bao tử, rối lọan tiêu hóa kéo dài, thường dùng phối hợp với Ngũ bội tử, Đảng sâm, Bạch truật, Trần bì, Kê nội kim, Sa nhân, Sinh khương.

Trị xơ cứng mạch, cao huyết áp, tai biến mạch não: thường phối hợp với Kê huyết đằng, Thạch xương bồ, Đơn bì, Cẩu tích, Đỗ trọng, Thỏ ty tử, Hoàng tinh. Thuốc chữa bệnh phụ nữ thời kỳ mãn kinh, giúp thông minh và trí nhớ, dùng lâu ngày.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

• PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

Do đó, trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của pH đến tốc độ sinh trưởng và phát triển của sợi nấm Linh chi để tìm được giá trị pH thích hợp cho sự phát triển của sợi nấm. Cách tiến hành: pha môi trường lỏng PG (potato glucose) với nồng độ pH khác nhau và đổ vào chai thuỷ tinh 100ml một lượng môi trường 20 ml. Môi trường được hấp khử trùng ở 121oC/15 phút, để nguội và cấy một lượng giống nhất định vào (mỗi lần cấy gắp 1 hạt lúa), ủ ở nhiệt độ phòng.

Chúng tôi khảo sát sự tích lũy sinh khối sợi nấm Linh chi trên môi trường lỏng PG Cách tiến hành: pha môi trường và đổ vào chai thuỷ tinh 100ml một lượng môi trường 20 ml. Tìm điều kiện tối ưu để thực hiện các quá trình hoặc chọn lựa thành phần tối ưu của nhiều phần tử trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật. Chỉ có những hệ số biểu diễn ảnh hưởng rất lớn và đáng kể mới được giữ lại trong phương trình hồi qui cuối cùng.

Khi ảnh hưởng của các yếu tố hay ảnh hưởng tương hổ giữa các yếu tố là đáng kể thì hệ số biểu diễn ảnh hưởng của các yếu tố đó luôn được giữ lại trong phương trình. Tuy nhiên, nếu không có kết tủa, chưa thể kết luận là không có alcaloid mà phải tiếp tục thử nghiệm phần 2. Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào dung dịch acid loãng có chứa alcaloid, nếu có alcaloid sẽ xuất hiện tủa màu trắng hoặc vàng nhạt.

Cần lưu ý vì tủa tạo thành có thể hòa tan trở lại trong lượng thừa thuốc thử hoặc hòa tan bởi ethanol có sẵn trong dung dịch thử. Hỗn hợp 2 dung dịch này lại để yên trong tủ lạnh 5oC sẽ thấy tủa màu sậm xuất hiện và tan trở lại, lọc và thêm nước cho đủ 100 ml. Dung dịch màu cam – đỏ được chứa trong chai màu nâu để che sáng, cất trong tủ lạnh, có thể giữ lâu vài tuần.

Nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff vào dung dịch acid loãng có chứa alcaloid, nếu có alcaloid sẽ xuất hiện tủa màu cam – nâu. Một đặc tính quan trọng của saponin là tính tạo bọt, nên đây là một trong những phương pháp chính xác để định tính sự hiện diện của saponin. Bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc cả 2 ống trong 1 phút và để yên, quan sát các cột bong bóng trong cả 2 ống nghiệm.

Chuyển dung dịch vào 1 ống nghiệm nhỏ khô, dùng pipet pasteur thêm cẩn thận 1 – 2 ml H2SO4 đậm đặc lên thành ống nghiệm để nghiên cho acid chảy xuống đáy ống nghiệm. Một qui trình thứ hai được ứng dụng rộng rãi để chiết các GLPs ở nhiệt độ thấp, nhằm ổn định cấu trúc sinh học của các GLPs.

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA NẤM LINH CHI (GANODERMA LUCIDUM)

• Tốc độ sinh trưởng hệ sợi nấm Ganodrma lucidum trên các môi trường lỏng .1 Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO 4 đến tốc độ tăng sinh khối sợi nấm

Thí nghiệm được bố trí 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 4 chai, mỗi chai chứa 20ml môi trường. Điều này có thể khi tăng Mg2+ vượt quá mức chịu đựng của tế bào, sẽ ức chế sự hoạt một số enzyme cần thiết trong quá trình tổng hợp tế bào cũng như sẽ giảm các phản ứng tổng hợp trong tế bào sợi nấm. Kết luận: Chúng tôi chọn hàm lượng MgSO4 là 3 g/l làm giá trị thực nghiệm cho bước thí nghiệm qui hoạch tiếp theo.

Nguồn kali đóng vai trò làm đồng yếu tố (cofactor), cung cấp cho các loại enzym hoạt động. Vì vậy chúng tôi tiến hành khảo sát hàm lượng KH2PO4 thích hợp cho môi trường nuôi cấy tơ nấm Linh chi. Thí nghiệm được bố trí 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 4 chai, mỗi chai chứa 20ml môi trường.

Dựa và biểu đồ 4.2, chúng tôi nhận thấy khi tăng hàm lượng KH2PO4 lên dần thì lượng sinh khối tăng. Mặt khác, khi hàm lượng KH2PO4 sử dụng vượt quá mức chịu đựng của tế bào nấm Linh chi thì lượng sinh khối thu được giảm. Kết luận: Trong thí nghiệm này, chúng tôi chọn hàm lượng KH2PO4 là 1 g/l làm giá trị thực nghiệm cho bước thí nghiệm qui hoạch tiếp theo.

Nguồn cacbon dùng để tổng hợp nên các chất: hydratcacbon, amino acid, acid nucleic, lipid… cần thiết cho sự phát triển của nấm. Trong sinh khối nấm, cacbon chiếm nửa trọng lượng khô, đồng thời nguồn cacbon cung cấp năng lượng cho quá trình trao đổi chất. Trong thí nghiệm này, chúng tôi khảo sát hàm lượng Glucose ảnh hưởng tới tốc độ tạo sinh khối sợi nấm Linh chi trên môi trường lỏng ở các mức thay đổi khác nhau.

Thí nghiệm được bố trí 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 4 chai, mỗi chai chứa 20ml môi trường. Dựa vào biểu đồ 4.3, chúng tôi nhận thấy khi tăng hàm lượng Glucose tăng lên dần thì sinh khối sở nấm tăng. Kết luận: Trong thí nghiệm này, chúng tôi chọn hàm lượng glucose là 20 g/l làm giá trị thực nghiệm cho bước thí nghiệm qui hoạch tiếp theo.

ẢNH HƯỞNG CỦA pH LÊN MÔI TRƯỜNG CẤY

Dựa vào biểu đồ trên chúng tôi nhận thấy sinh khối tơ nấm Linh chi có khả năng tăng trưởng tốt trong khoảng pH = 4,5 đến pH = 7,0.