Nghiên cứu công nghệ sản xuất dầu béo bằng lipaza từ vi sinh vật

Trình tự axit amin

Chẳng hạn như trình tự của 20 axit amin đầu của lipase từ động vật có vú giống với vùng N- của lipase từ P.camemberti và giống một phần với lipase từ Humicola lanuginosa và Aspergillus oryzae nhưng khác nhau so với lipase từ P.Cyclopium lipase 1. Đã có rất nhiều thí nghiệm được triển khai nhằm tìm hiểu cấu trúc của lipase, trong đó cấu trúc ba chiều của lipase được coi là cơ sở để hiểu được phản ứng động học, đặc hiệu cơ chất, tiên đoán những đặc điểm sinh hoá và hoạt động của lipase tại bề mặt phân pha dầu nước.

Tính đặc hiệu cơ chất

Gần đây người ta đã phát hiện được lipase từ cây cải dầu có tính chất xúc tác sự thuỷ phân triolein nhanh hơn khoảng 70 lần so với sự thuỷ phân của tri-linolein dưới những điều kiện không có nước, lipase này xúc tác sự este hoá axit oleic bằng butanol[14]. Lipase xúc tác phản ứng thuỷ phân dầu không tan thành các sản phẩm hoà tan; phản ứng này cũng có thể xảy ra theo chiều ngược lại trong đó lipase xúc tác để tạo thành acyl glyxerol từ glyxerol và axit béo.

Phương pháp gắn enzym bằng liên kết đồng hoá trị

Saxena và cộng sự đã tách và tinh sạch lipase từ Aspergillus carneus qua cột tương tác kỵ nước Octyl Sepharose đạt được mức độ tinh sạch là 24,1 và hiệu suất thu hồi là 38,4% (2003)[25]. Pernas và cộng sự đã tiến hành tinh sạch qua cột DEAE- Sephacel đạt độ tinh sạch là 2,3 và hiệu suất thu hồi là 4,9%. Qua kiểm tra độ tinh sạch bằng chạy điện di protein biến tính trên SDS-PAGE xác định được khối lượng phân tử là 60 kDa (2000)[15].

Dựa trên cơ sở lý thuyết đó, Carneiro-da-Cunha và cộng sự đã cố định lipase từ Candida rugosa lên màng xenluloza và dẫn xuất của celluloza, sử dụng tác nhân hoạt hoá là cacbođiimit (HN=C=NH) thu được kết quả cố định trờn màng celluloza axetat độ hoạt động là 0(àmols-1m-2);.

Phương pháp gói enzym trong khuôn gel

Nylon-6 có lỗ hổng nhỏ được sử dụng làm chất mang cho việc cố định lipase.

NGUYÊN LIỆU 1. Chủng vi sinh vật

- Máy lọc hút chân không - Máy ly tâm lạnh allegra 64R - Hệ thống sắc ký cột FPLC.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Phương pháp vi sinh vật

Dựa trên khả năng xúc tác thuỷ phân lipit của lipase, xác định lượng axit béo tạo ra trong 15 phút bằng lượng NaOH cần bổ sung để duy trì pH cố định. Sau khi ổn định pH và nhiệt độ, đo độ tự thuỷ phân của dung dịch cơ chất trong 15 phút để giữ pH luôn luôn bằng 8,3 (lượng NaOH tiêu tốn là a ml). Trong đó nhóm tích điện (+) là chất mang trao đổi với các ion (-) và do đó chúng được gọi là các chất trao đổi anion và ngược lại chúng được gọi là chất trao đổi cation.

Dịch enzym sau kết tủa phân đoạn bằng etanol nồng độ 60% được cho qua cột DEAE cellulose với điều kiện tách phân đoạn như sau: cột được cân bằng trong đệm Tris-HCl 25mM, pH 7,5; tốc độ chảy 1 ml/phút với gradien nồng độ 0-0,25M NaCl, mỗi phân đoạn thu mẫu là 1ml/ống.

Tìm điều kiện nuôi thu lipase từ Bacillus sp

Chúng tôi đã nuôi cấy chủng vi sinh trong 6 môi trường khác nhau về thành phần (bảng 5) và xác định hoạt tính lipase trong dịch nổi sau 120 giờ nuôi cấy. Kết quả cho thấy hoạt độ enzym đạt cao nhất khi nuôi cấy trong môi tr−ờng BMMY (67 U/ml canh tr−ờng). Thí nghiệm tiếp sau đây nhằm khảo sát ảnh h−ởng củamột số cơ chất cảm ứng tới khả năng sinh tổng hợp lipase.

Tiến hành nuôi với 6 loại môi trường khác nhau, cứ 24 giờ lấy mãu để xác định hoạt tính và tốc độ phát triển của vi khuẩn (OD).

Tách và tinh chế lipase từ Candida rugosa

Kết quả cho thấy các cơ chất này không làm tăng khả năng sinh tổng hợp enzym của chủng nghiên cứu. Qua thí nghiệm này cho thấy ở nồng độ cồn từ 67% trở xuống chỉ có protein tạp bị kết tủa vì vậy chúng ta có thể kết tủa phân. Tinh sạch lipase bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion-DEAE- cellulose trên thiết bị FPLC.

Sắc ký đồ hình 2 cho thấy lipase sau khi qua cột trao đổi ion DEAE - cellulose xuất hiện 3 pick.

Đặc tính của lipase

Tiến hành ủ enzym với dung dịch đệm chứa các ion kim loại trên với nồng độ 10mM trong 30 phút, ở điều kiện nhiệt độ phòng (30°C) đem xác định hoạt độ theo phương pháp chuẩn độ so với mẫu đối chứng không ủ ion kim loại để biết được mức độ ảnh hưởng của chúng với enzym lipase. Điểm đẳng điện của protein enzym không những có ý nghĩa lý thuyết mà còn có ý nghĩa thực tiễn trong sản xuất vì vậy cần phải xác định điểm đẳng điện của enzym bằng cách đo độ đục của dung dịch enzym khi kết tủa với cồn theo Droxov (1970). Trong quá trình xử lý nhiệt, có thể tr−ớc tiên một số liên kết hydro trong mạng l−ới liên kết hydro tham gia vào việc giữ vững cấu trúc của lipase bị đứt gãy dẫn đến cấu trúc của enzyme bị biến đổi, làm cho cơ chất không liên kết đ−ợc với enzyme và không bị chuyển hóa d−ới tác dụng của enzyme.

Nếu xử lý enzyme ở một nhiệt độ quá cao, các liên kết trong phân tử enzyme sẽ hoàn toàn bị phá hủy làm enzyme bị mất hoạt tính và lúc này khi đ−a về nhiệt độ bình thường thì hoạt tính của nó không thể hồi phục lại được. Đặc tính này cùng với khả năng thủy phân tốt các loại dầu ăn khác nhau cho thấy đây là một loại enzyme rất thích hợp cho ngành công nghiệp sản xuất các chất tẩy rửa hoạt động ở một môi trường có tính kiềm cao. Tác động của kim loại đến lipase trong quá trình xúc tác phản ứng có thể theo nhiều cách khác nhau: (a) Tham gia vào việc giữ vững ổn định cấu dạng không gian cần thiết của phân tử lipase để đảm bảo việc thực hiện các phản ứng enzyme.

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG LIPASE từ Candida rugosa

Khảo sát khả năng sử dụng lipase tan trong sản xuất phomat Trong quá trình sản xuất phomat từ sữa tươi, ở giai đoạn lên men đông tụ phomat người ta sử dụng renin và một số proteaza axit tính hoặc kiềm tính làm tác nhân đông tụ sữa. Trong giai đoạn ủ chín có thể bổ sung lipase nhằm làm tăng hương vị đặc trưng cho phomat. Để khảo sát khả năng sử dụng lipase trong quá trình sản xuất phomat, tiến hành thí nghiệm trên 2 mẫu.

Kết quả đánh giá cảm quan các chỉ tiêu của sản phẩm phomat có và không bổ sung lipase cho thấy các chỉ tiêu của sản phẩm phomat có sử dụng lipase đều tốt hơn cả về màu sắc và hương vị so với phomat không bổ sung lipase.