Đánh giá tác động của thành phần môi trường đến quá trình sinh tổng hợp chitinase từ nấm Trichoderma

LỜI MỞ ĐẦU

Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất protein, có cấu trúc phân tử phức tạp và tinh vi, hoạt lực xúc tác cao hơn nhiều so với chất xúc tác thông thường, có tính đặc hiệu cao…. Chitinase là một trong những nhóm enzyme quan trọng trong các enzyme công nghiệp, nó chứa các đơn phân là N-acetyl-Glucosamine, liên kết với nhau bởi các liên kết 1,4-β-glucoside. Enzyme chitinase được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như động vật, thực vật, nấm, vi khuẩn … Tuy nhiên, những năm gần đây việc gia tăng sử dụng vi sinh vật là nguồn cung cấp chitinase đang được sử dụng nhiều, sản phẩm của nó tạo ra nhiều hơn và rút ngắn thời gian thu nhận hơn, nhưng giá thành các chế phẩm thu được vẫn còn khá cao, do đó sử dụng enzyme trong sản xuất vẫn còn hạn chế.

Những nguồn sinh vật để thu nhận enzyme chitinase đáng kể là các chủng vi khuẩn thuộc các chi Enterobacter và Streptomces, các chủng nấm sợi thuộc các chi Asperillus, Penicillium, và Trichoderma, và một số động vật nguyên sinh. Nấm sợi Trichoderma không chỉ là một nhóm có tính đa dạng sinh học cao, nguồn lợi tài nguyên quí mà còn có vai trò rất quan trọng trong phòng trừ sinh học sâu hại cây trồng và trong y dược. Vì những ứng dụng rộng rãi của chitinase, mục đích của tôi nhằm nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase từ Trichoderma trong môi trường cho hoạt tính là cao nhất.

Trình tự amino acid hoàn toàn khác với chitinase nhóm I và II

Họ Glycohydrolase 20: Họ Glycohydrolase 20 bao gồm β-N-acetyl-D- Glucosamin acetylhexosaminidase từ vi khuẩn, Streptomyces và người. Dựa vào trình tự đầu amin (N), sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện, peptid nhận biết và vùng cảm ứng, người ta phân loại enzyme chitinase thành 5 nhóm: [33].

Dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn chitin (vùng giàu cystein) có thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hóa ở thực

• Qui hoạch thực nghiệm 1. Định nghĩa

Trong quá trình ký sinh của Trichoderma trên những ký chủ khác nhau thì mức độ cảm ứng và thành phần các sản phẩm enzyme tạo thành khác nhau, chủ yếu là 1,4- β - N - acetylglucosaminiase 102 kDa và 72 kDa (CHIT102, CHIT72) và một vài enzyme endochitinase của nhóm II. Sự hình thành hệ enzyme chitinase in vitri bị ức chế bởi tỷ lệ gia tăng của lượng đường glucose, sucrose và sản phẩm cuối, điều này cho thấy rằng quá trình sinh tổng hợp enzyme được điều chỉnh một cách đặc hiệu bởi sự ức chế dị hóa. Sự hoạt động của hệ enzyme chitinase bị ảnh hưởng bởi các hoạt động của những hợp chất cảm ứng khác nhau như các enzyme phá hủy vách khác (protease và glucanase), các liên kết protein trong vách tế bào chất, permease và chất kháng sinh.

Các chủng nấm mốc cho enzyme chitinase cao như: Trichoderma, Gliocladium, Calvatia,..đặc biệt là ở các loài nấm lớn như Lycoperdon, Coprinus..các nấm phân hủy chitin cũng được tìm thấy trong các thủy vực như loài nấm Karlinggiomyces asterocystic thuộc lớp Phycomycetes [31]. Tương tự như ở vi khuẩn, enzyme chitinase của nấm đóng vai trò quan trọng về mặt dinh dưỡng, nhưng khác là hoạt động của chúng rất linh hoạt trong quá trình phát triển và trong sự phát sinh hình thái của nấm bởi vì chitin là thành phần chính của vách tế bào nấm. Từ một số động vật nguyên sinh và từ các mô, tuyến khác nhau trong hệ tiêu hóa của nhiều loài động vật không xương: ruột khoang, giun tròn, thân mềm, chân đốt (ví dụ trong dịch ruột của ốc sên Helix aspersa), ta có thể thu nhận được enzyme chitinase.

Sự kích thích hoạt tính enzyme chitinase là dấu hiệu trả lời của tế bào đối với tác động của tác nhân gây bệnh, đi kèm với sự kích thích hoạt tính phân giải amoniac, phenylalanin làm tiền đề cho sự tổng hợp lignin và phytoalexin ở thực vật. Những thí nghiệm in vitro gần đây cho biết sự nẩy mầm của bào tử và sự kéo dài sợi nấm của các nấm gây bệnh thực vật như: Botrytis cinerea, Fusarium solani, F.graminearum..bị ức chế bởi enzyme phân giải chitin và glucan tách chiết từ Trichoderma Harzianum. Griseus có khả năng thủy phân chitin huyền phù thành chitobiose tiếp tục được cải biến hóa học thành một dẫn xuất disaccharid mới 2- acetamido- 2- deoxy- D- allopyranose, đây là chất trung gian để tổng hợp nên chất ức chế enzyme.

1.2.9.2.2 Chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm do vi nấm bằng enzyme chitinase Nhiều phương pháp chẩn đoán bệnh nấm được đề xuất như ELISA, sự ngưng kết kháng thể, mẫu dò phân tử.., để phát hiện đặc hiệu các nấm gây bệnh trong các dịch cơ thể nhưng giá thành quá cao. Hiện nay, các nhà khoa học đã đề xuất một phương pháp chẩn đoán mới các bệnh truyền nhiễm do nấm bằng cách sử dụng enzyme chitinase đã được phân lập tạo dòng từ Vibrio parahemolyticus (đặt tên là chitinase VP1), nó kết hợp chặt chẽ với chitin và có thể sử dụng như một mẫu dò trong việc chẩn đoán với độ nhạy cao, để nhận diện một cách đặc hiệu các vách tế bào nấm hay những vết chồi nấm men trong những lát cắt mẫu mô bệnh [34]. Chế phẩm thuốc mới: enzyme chitinase và các dược chất kháng nấm Hiện nay, các nhà khoa học đề nghị sử dụng chitinase với các tác nhân kháng nấm có thể chấp nhận khác nhằm bổ trợ cho hoạt động nội sinh của chitinase [3, 20].

Về sau trong những năm 1989, việc thu nhận chitinase được tiếp tục nghiên cứu trên các đối tượng khác như Serratia liquefaciens (S.Joshi, Kozlowski), Myrothecium verrucaria (P. Vyas và M.V. Deshpand) và vẫn chủ yếu tìm hiểu ứng dụng của chitinase trọng việc phá vỡ vách tế bào nấm. Kucheryavykh (2003) đã nghiên cứu nuôi cấy nhiều chủng nấm khác nhau trong đó có các chủng thuộc các chi nấm Aspergillus và Trichoderma…Tuy nhiên, những nghiên cứu về chitinase từ nấm sợi phần lớn thực hiện trên môi trường nuôi cấy lỏng. Qui hoạch thực nghiệm là tập hợp các tác động nhằm đưa ra chiến thuật làm thực nghiệm từ giai đoạn đầu đến giai đoạn kết thúc của quá trình nghiên cứu đối tượng (từ nhận thông tin mô phỏng đến việc tạo ra mô hình toán, xác định các điều kiện tối ưu) ; trong điều kiện đã hoặc chưa hiểu biết đầy đủ về cơ chế của đối tượng.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Hóa chất và thiết bị sử dụng 1. Hóa chất

Các chủng vi nấm Trichoderma được nuôi cấy trong các bình tam giác 150ml, chứa 50ml môi trường đã được hấp ở 121oC trong 30 phút, trên máy lắc ổn nhiệt với tốc độ 180 vòng/phút và thời gian chọn thử nghiệm trong các lần nuôi cấy lỏng ban đầu là 30oC,. Chủng nhận từ nơi giữ giống cần cấy chuyền trên môi trường PGA giữ ở nhiệt độ 30oC từ 2 đến 3 ngày cho nấm phát triển sau đó cho vào tủ lạnh bảo quản ở 10oC, sau 7 đến 10 ngày cần cấy chuyền để tránh già hóa giống và chủng mất hoạt tính. Phương pháp này dựa vào sự hình thành các dẫn xuất pyrole khi glucosamin được đun nóng trong thuốc thử 2,4 pentadion.

Đường amin hydrochlorid được đun nóng với 2,4 pentadion trong dung dịch kiềm khoảng 1 giờ trước khi thêm thuốc thử Erlich I. Từ dung dịch này, pha cỏc dung dịch glucosamin chuẩn cú nồng độ 10 - 250 àg/ml Nồng độ glucosamin chuẩn (.  Nguyên tắc: Hoạt tính hệ enzyme chitinase được xác định dựa trên phương pháp định lượng sản phẩm N - acetyl - D- Glucosamin của quá trình phân giải chitin.

Do đặc tính của chitin không tan trong nước nên để tiến hành xác định hoạt độ của enzyme chitinase cần huyền phù hóa chitin. Lượng glucosamin tạo thành sau phản ứng thủy giải bởi enzyme chitinase được xác định theo phương pháp Elson - Morgan. Một đơn vị hoạt tớnh (đvht) của enzyme chitinase tương ứng với 1àg glucosamin tạo ra trong thời gian thủy phân chitin 1 phút ở nhiệt độ phản ứng.

Do hoạt tính enzyme chitinase thu được khi nuôi cấy lỏng của chủng Trichoderma thường không cao nên trong các khảo sát sử dụng n = 1. Để xác định hàm lượng các thành phần tối ưu cho quá trình nuôi cấy chủng nấm sợi thu chế phẩm enzyme chitinase, chúng tôi dùng thực nghiệm yếu tố toàn phần. Dựa vào hàm lượng của các thành phần, tôi chọn 4 thành phần là (NH4)2SO4, KH2PO4, chitin, peptone trong môi trường nuôi cấy để nghiên cứu tối ưu hóa theo phương pháp qui hoạch thực nghiệm.

Vì không làm thí nghiệm song song nên để xác định phương sai lặp, tôi tiến hành làm 3 thí nghiệm tại tâm [84,5]. Từ kết quả thu được chọn thành phần môi trường nuôi cấy thích hợp cho chủng sinh trưởng và sinh hoạt tính chitiiase cao nhất. Nhờ tính trực giao của ma trận kế hoạch, tất cả các hệ số hồi qui được xác định theo công thức sau: [117,5].