Nghiên cứu, sản xuất và thử nghiệm hiệu quả miễn dịch của vaccine nhược độc đông khô phòng bệnh viêm phế quản truyền nhiễm ở gà

NỘI DUNG

+ Nước niệu nang ủó gõy nhiễm virỳt IB, kiểm tra vụ trựng ủạt yờu cầu (ở cỏc mụi trường qui ủịnh), ủược pha với chất bổ trợ sữa tỏch bơ (Skim milk) với một tỷ lệ thớch hợp. Cú nhiều phương phỏp ủể xỏc ủịnh ủộ ẩm như: Phương phỏp sấy khụ vắcxin trong chõn khụng, phương phỏp xỏc ủịnh ủộ ẩm khụng hoàn toàn hoặc phương phỏp cộng hưởng từ tớnh nguyờn tử. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………34 sỏng màu tớm ủậm thỡ lọ vắcxin cú chõn khụng cao, nếu thiết bị phỏt ra ỏnh sỏng màu tớm nhạt hoặc xanh thỡ lọ vắcxin ủú cú chõn khụng thấp hoặc khụng cú chõn không.

Vắcxin ủược xem là ủạt tiờu chuẩn khi cỏc mụi trường kiểm tra không có vi khuẩn hoặc chỉ có một khuẩn lạc hiếu khí không dung huyết trong một liều sử dụng ủối với vắcxin ủụng khụ. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………35 Nếu trong quá trình quan sát, nhiều hơn hai gà bị chết với nguyên nhân khụng phải ủặc trưng của bệnh IB, thỡ tiến hành kiểm tra nhắc lại. Vắcxin ủược xem là ủạt tiờu chuẩn hiệu lực khi ớt nhất 90% số gà ủó sử dụng vắcxin khụng cú mặt của virỳt IB trong khớ quản và ≥ 80% số gà ủối chứng cường ủộc cú mặt của virỳt IB trong khớ quản.

Do ủú, phản ứng HA sử dụng ủể xỏc ủịnh sự cú mặt của virỳt IB; phản ứng HI ủể phõn biệt virỳt IB với cỏc virỳt khỏc và kiểm tra kháng thể trong huyết thanh của gà. − Trong quỏ trỡnh tiến hành phản ứng, ủể một dóy làm ủối chứng dương (chỉ cú virỳt và hồng cầu) và một dóy làm ủối chứng õm (Chỉ cú PBS và hồng cầu).

KẾT QUẢ KHẢO SÁT ðẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VIRÚT GIỐNG Muốn sản xuất ra một loại vắcxin tốt ủiều quan trọng nhất là phải chuẩn bị

Khõu ủầu tiờn là giống nguyờn chủng ủược nhận từ nước ngoài, sau ủú ủược cấy chuyển trên trứng gà có phôi sạch bệnh thành các lô giống sản xuất và từ các lô giống sản xuất sẽ ủược dựng ủể sản xuất ra cỏc lụ vắcxin khỏc nhau. Khảo sỏt ủặc tớnh gõy nhiễm của virỳt giống IB trờn trứng gà cú phụi Giống virỳt IB ủụng khụ ủược pha trở lại bằng dung dịch PBS- thành cỏc nồng ủộ từ 10-2 - 10-4. Lô thí nghiệm 1 và lô thí nghiệm 2: Toàn bộ số trứng bị chết thai sau 72 giờ gây nhiễm nhưng tập trung ở 36 và 48 giờ, nhưng ở lô thí nghiệm 1 trứng bị chết thai sớm hơn và nhiều hơn so với lô thí nghiệm 2.

Cỏc lụ thớ nghiệm: Những thai chết ủều bị xung huyết, thai cũi cọc, co quắp, chõn ụm chặt lấy ủầu, màng nhung niệu dầy, bỏm chặt lấy thai, nhiều thai bị biến dạng phỏt triển khụng cõn ủối. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………43 Hỡnh 3.3 So sỏnh bệnh tớch thai của những phụi chết ở thời ủiểm 36 giờ. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………44 Như vậy kết quả khảo sỏt ủặc tớnh gõy nhiễm của virỳt IB trờn trứng gà cú phụi cho thấy ở cỏc ủộ pha loóng khỏc nhau thỡ tỷ lệ chết thai ở cỏc thời ủiểm cũng khác nhau.

Sau khi chuẩn ủộ, cho thấy virỳt IB nhược ủộc ủụng khụ thớch nghi trờn trứng gà cú phụi ủó cú ủặc tớnh gõy nhiễm ở nồng ủộ phự hợp với lý lịch giống ban ủầu. Qua hỡnh 3.5, chỳng tụi nhận thấy hiệu giỏ HA trung bỡnh ở thời ủiểm 36 giờ và 48 giờ của cỏc lụ trứng thớ nghiệm ủạt mức cao nhất, cú nghĩa rằng ở thời ủiểm ủú hàm lượng virỳt trong dịch niệu nang cũng ủạt mức cao nhất.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT VẮCXIN IB NHƯỢC ðỘC ðÔNG KHÔ

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………53 lượng huyễn dịch virút dùng pha vắcxin nhiều hơn lượng sữa, cho nên trong huyễn dịch ủể ủụng khụ, vật chất khụ khụng ủủ ủể tạo khuụn vắcxin, trường hợp này những lọ vắcxin ở vị trí giữa của khay thường bị chảy, vắcxin không tạo thành khuụn mà thường tạo thành một chất keo và rất khú hoà tan khi ủược pha trở lại. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………58 Nhỡn vào hỡnh 3.7 cho thấy: Cỏc ủường biểu diễn về ủộ chõn khụng, nhiệt ủộ buồng ngưng tụ, nhiệt ủộ của chế phẩm vắcxin ở giai ủoạn làm ủụng và giai ủoạn sấy khụ ủều ủược thể hiện trong cả quỏ trỡnh ủụng khụ. Kết quả này một lần nữa lại khẳng ủịnh quy trỡnh ủụng khụ vắcxin IB ủược xõy dựng là phự hợp, việc sử dụng nguyờn liệu như chai, lọ, nỳt ủể ủụng khụ vắcxin là ủảm bảo ủộ chõn khụng trong mỏy cao và ổn ủịnh ở tất cả cỏc lụ vắcxin IB ủụng khô.

Nếu lần kiểm tra này ủạt kết quả tốt thỡ toàn bộ cỏc lụ vắcxin ủược sản xuất từ lụ giống ủú khụng phải kiểm tra hiệu lực bằng biện phỏp cụng cường ủộc mà cú thể tiến hành kiểm tra hiệu lực bằng phương phỏp thay thế. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………70 Kết quả kiểm tra hiệu lực bằng phương phỏp xỏc ủịnh lụng rung khớ quản ủó xỏc ủịnh ủược tỷ lệ bảo hộ của cỏc lụ gà thớ nghiệm tương ủương với kết quả kiểm tra hiệu lực bằng cách gây nhiễm trên trứng. Sở dĩ gà sử dụng vắcxin IB nhược ủộc ở 2 lần vào 7 và 14 ngày, cú tỷ lệ bảo hộ cao hơn những gà sử dụng vắcxin một lần là do khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể gà lần thứ 2, cỏc khỏng thể ủó sinh ra sau khi sử dụng vắcxin lần thứ nhất chỉ việc "nhớ lại" ủể sinh khỏng thể, cỏc khỏng thể ủặc hiệu này sẽ kết hợp với khỏng nguyên tạo thành một phức hợp kháng nguyên – kháng thể và kết quả kháng nguyên bị loại trừ, còn lượng kháng thể sinh ra sẽ nhiều hơn lần thứ nhất.

Trong quỏ trỡnh bảo quản vào cỏc thời ủiểm 0 thỏng, 3 thỏng, 6 thỏng, 9 thỏng và 12 tháng chúng tôi tiến hành lấy mẫu các lô vắcxin thí nghiệm kiểm tra vật lý và chuẩn ủộ xỏc ủịnh hiệu giỏ virỳt trong cỏc mẫu vắcxin. Cỏc lọ này ủược kiểm tra cỏc chỉ tiờu vật lý của vắcxin ủụng khụ như hỡnh thỏi, màu sắc,… sau ủú ủược hoàn nguyờn trở lại bằng dung dịch PBS-, trộn lại với nhau, và tiến hành chuẩn ủộ ủể xỏc ủịnh hiệu giỏ virỳt trong 1 liều vắcxin. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………74 Như vậy, qua cỏc lụ thớ nghiệm trờn ủó cho thấy: Virỳt IB cú tớnh khỏng nguyờn bền vững và ổn ủịnh với nhiệt ủộ trong quỏ trỡnh ủụng khụ và trong thời gian bảo quản, hiệu giỏ virỳt là ổn ủịnh, khụng thay ủổi trong cỏc lụ kiểm tra và ủạt 103,6 EID50, hiệu giá này bằng hiệu giá virút của một liều vắcxin IB khi mới sản xuất.

Cũn ủối với vắcxin IB ủụng khụ nờn bảo quản ở nhiệt ủộ (+2)-(+8)0C, vỡ ở nhiệt ủộ này hiệu giỏ virỳt trong vắcxin vẫn ủảm bảo, tớnh khỏng nguyờn của virỳt khụng thay ủổi, ủồng thời cỏc nguyờn liệu dựng ủể chứa vắcxin khụng bị ảnh hưởng.

KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM VẮCXIN IB TẠI XÍ NGHIỆP THUỐC THÚ Y TRUNG ƯƠNG

Mặc dự ở nhiệt ủộ lạnh sõu trong quỏ trỡnh ủụng khụ cũng như nhiệt ủộ bảo quản thời gian dài, cỏc lớp protein của virỳt ủó bảo vệ tốt làm cho virỳt khụng bị phỏ huỷ và tớnh khỏng nguyờn vẫn ủược bảo toàn. Mặt khỏc do sản xuất với một số lượng rất lớn nhằm ủỏp ứng nhu cầu sử dụng, nếu bảo quản vắcxin ở lạnh sâu sẽ rất khó khăn về thiết bị bảo quản cũng như về chất lượng của các nguyên liệu chứa vắcxin (như chai, lọ, nút). Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………75 Lô thí nghiệm 1: Chúng tôi bố trí nuôi 100 con gà Lương phượng 1 ngày tuổi, trọng lượng bình quân là 42 g.

7 ngày tuổi, chỳng tụi tiến hành sử dụng vắcxin theo ủường nhỏ mắt và nhỏ mũi, mỗi con 1 liều vắcxin quy ủịnh, 14 ngày tuổi sử dụng vắcxin nhắc lại lần hai cựng liều lượng và ủường sử dụng như trờn. Nhưng qua theo dừi, chỳng tụi nhận thấy cả hai lụ thớ nghiệm ủều khụng phỏt hiện ủược bất kỳ dấu hiệu lõm sàng hoặc triệu chứng hụ hấp ủặc trưng nào của bệnh IB, ngay cả những con bị chết khi mổ khỏm kiểm tra bệnh tớch ủều khụng phải nguyờn nhõn do IB gõy ra. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………78 Dựa vào hình 3.9 cho thấy hàm lượng kháng thể của hai lô gà thí nghiệm tăng nhanh sau khi sử dụng vắcxin.

Theo tỏc giả Thayer và cộng sự, (1987) ủó xỏc ủịnh ủược hiệu giỏ khỏng thể HI khỏng virỳt IB bằng 5 log2 tương ủương với mức hiệu giỏ tối thiểu cần thiết ủể bảo vệ chống lại chủng cường ủộc M41 [77]. Theo tỏc giả Gough và Alexander, (1979) quỏ trỡnh ủỏp ứng miễn dịch của gà ủược sử dụng vắcxin IB là rất ngắn và hàm lượng khỏng thể giảm nhanh sau 9 tuần sử dụng vắcxin.