Đánh giá Đa dạng di truyền của 5 Quần thể Gà nội Việt Nam sử dụng Kỹ thuật Microsatellite
MỤC LỤC
Một số nghiên cứu sử dụng kỹ thuật microsatellite
Microsatellite được Tổ chức Nông Lương Liên Hợp Quốc - FAO dùng làm công cụ phân tử đầu tiên cho dự án MoDAD (Measurement of Domestic Animal Diversity) nhằm đánh giá sự đa dạng di truyền của động vật bản địa. Kết quả nghiên cứu các giống gà nội địa Trung Quốc cho thấy khi phân tích bằng microsatellite thì tần số dị hợp tử quan sát được là cao nhất (75.91%), tiếp theo là phương pháp RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) (26.32%), cuối cùng là phương pháp phân tích allozyme (22.09%) [44]. Khi sử dụng 14 locus microsatellite để phân tích mối quan hệ di truyền giữa các quần thể gà bản địa khác nhau (chủ yếu từ Đức và Ucraina với tổng số 224 cá thể của 20 quần thể) và với gà rừng, việc lập cây quan hệ di truyền đã được tiến hành và thu được 3 nhóm chính [32].
42 chỉ thị microsatellite đã được sử dụng để phân tích 23 dòng gà cao sản của các giống gà Leghorn, gà rừng, gà Fayoumi và gà Tây Ban Nha, qua đó tính được được khoảng cách di truyền giữa gà rừng với các dòng gà khác [45]. Việc nghiên cứu quần thể gà Hà Giang đã kết luận rằng, trong sự vắng mặt của bất cứ cấu trúc quần thể gà nào trong phạm vi tỉnh, thì gà H’mong lại chia sẻ vốn gen chung với các giống gà khác [8]. Việc sử dụng 29 microsatellite khi nghiên cứu 9 giống gà nội và 2 giống gà Trung Quốc đã xác định rằng các giống gà Việt nam tạo nên vốn gen khác với các giống gà Trung Quốc, các giống gà miền Bắc tạo nên một vốn gen không có cấu trúc [14].
Sự khác biệt của các giống gà Việt nam quan sát được giữa miền Bắc và Duyên hải miền Trung cũng như đồng bằng Cửu Long chỉ ra rằng sự phân nhóm các giống gà Việt nam có quan hệ tới sự phân cách về địa lý của chúng [14].
Các đặc điểm di truyền quần thể
Các đại lượng di truyền đặc trưng cho các quần thể gà
Nghiên cứu đã chỉ ra có sự khác biệt di truyền giữa 3 nhóm gà theo khoảng cách địa lý, các quần thể gà đều ở trạng thái cân bằng Hardy - Weinberg và không bị ảnh hưởng bởi giao phối cận huyết. Số lượng lớn alen chung giữa gà Hà Giang và gà rừng, cũng như các kết quả phân tích cụm Bayes đã đề xuất rằng dòng chảy gen đã diễn ra từ gà rừng tới gà Hà Giang [8]. Hệ số cận huyết (ký hiệu là Fis) xét tại một locus ở một cá thể là xác xuất để 2 alen thuộc locus đó, cùng sinh ra từ một alen tổ tiên, giống hệt nhau4.
Fis > 0, quần thể thiếu hụt dị hợp tử do giao phối cận huyết hoặc đồng giao, hoặc do sự chọn lọc các cá thể đồng hợp nếu có sự mất cân bằng liên kết giữa locus được chọn (một alen thích hợp) và một chỉ thị. Định luật cân bằng Hardy - Weinberg được phát biểu như sau6: biến dị di truyền trong một quần thể sẽ duy trì không đổi từ thế hệ này đến thế hệ khác nếu không có các yếu tố gây rối. Khi việc giao phối là ngẫu nhiên trong một quần thể lớn mà không có các trường hợp gây rối, thì định luật dự đoán rằng cả tần số alen và kiểu gen sẽ duy trì không đổi bởi chúng ở trong trạng thái cân bằng.
Tương tự, chọn lọc tự nhiên và giao phối không ngẫu nhiên dẫn đến các thay đổi trong tần số gen, do một vài alen trợ giúp hoặc gây hại tới sự thành công sinh sản của các cá thể mang chúng.
Mối quan hệ di truyền giữa các quần thể gà
Giá trị DS được tính theo Cavalli-Sforza và Edwards [9] cùng với giá trị DS được tính theo Golstein [19] dựa trên giả định duy nhất về sự lạc dòng di truyền. Lượng cá thể và số locus lấy mẫu có ảnh hưởng đến kết quả tính khoảng cách di truyền, nên tối thiểu 25 cá thể mỗi quần thể phải được sử dụng và từ 25 đến 30 locus microsatellite với 4 đến 10 alen mỗi locus phải được lập kiểu gen [7]. Việc lập cây dựa vào phương pháp này sẽ không chính xác khi quần thể gặp hiệu ứng thắt cổ chai (một hiện tượng tiến hóa trong đó tỉ lệ đáng kể của quần thể hoặc loài bị giết hoặc bị ngăn chặn sinh sản), hoặc gặp hiện tượng lạc.
Atteson [6] đã chứng minh rằng nếu khoảng cách di truyền có sai số rất nhỏ, thì vẫn nhận được cây quan hệ di truyền đúng, nghĩa là phương pháp neighbor joining có tính nghiêm ngặt, vững chắc. Việc này được thực hiện bằng cách lấy ngẫu nhiên các mẫu con trong tập dữ liệu, dựng cây từ chúng và tính toán tần số mà các phần khác nhau của cây được tạo ra trong những mẫu con ngẫu nhiên này. Nếu nhóm X được tìm thấy ở mọi cây lập từ các mẫu con, thì sự xác nhận bootstrap của nó là 100%, và nếu nhóm đó được tìm thấy chỉ 2/3 các cây mẫu con, thì sự xác nhận bootstrap của nó là 67%.
Đây là một kiểm định đơn giản, nhưng các phân tích bootstrap của các cây quan hệ di truyền đã biết (các quần thể virus tiến hóa trong phòng thí nghiệm) chỉ ra rằng, nói chung bootstrap là một thước đo tin cậy về tính chính xác của cây quan hệ di truyền, và giá trị 70% hoặc cao hơn cho biết xác suất cây đúng với thực tế là trên 95% [22].
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu và địa điểm thu mẫu
- Các kỹ thuật thực nghiệm được sử dụng trong nghiên cứu .1 Lấy mẫu máu, tách và đánh giá chất lượng ADN
Lấy mỗi cá thể khoảng 1 ml máu từ tĩnh mạch cánh bằng loại kim và ống lấy mẫu chuyên dụng, chuyển ngay mẫu máu sau khi lấy vào tube eppendorf 1.5 ml có nắp kín chứa 50 μl dung dịch EDTA 0.5M, lắc nhẹ cho đều sau đó chuyển mẫu vào hộp lạnh để bảo quản. Nồng độ của dung dịch axit nucleic được xác định bằng cách đo độ hấp thụ tại bước sóng 260 nm trong máy quang phổ kế. Bộ kít Multiplex Master Mix PCR của hãng Quiagen được sử dụng để thực hiện các phản ứng PCR đa mồi khuếch đại cùng lúc nhiều locus microsatellite.
Các cặp mồi microsatellite được sử dụng trong nghiên cứu Locus NST Trình tự mồi (5' -> 3') xuôi (ở trên),. Hệ số cận huyết (Fis) được tính theo công thức: , với Fisk là hệ số cận huyết tại locus k ở một quần thể, Hok, Hsk lần lượt là tần số dị hợp tử quan sát và tần số dị hợp tử mong đợi, tính dựa trên tần số alen quan sát với giả định quần thể ở trạng thái cân bằng Hardy - Weinberg, tại locus k ở mỗi quần thể gà. Do hai công thức tính Fst và DS rất phức tạp, chỉ phù hợp với các chương trình máy tính nên không được trình bày trong nghiên cứu này.
Nhưng giá trị quan sát này ở các quần thể tự nhiên hầu hết đều khác 0, và ta cần phải xác định ý nghĩa thống kê của sự khác 0 đó bằng việc đặt ra và kiểm định giả thiết H0 và đối thiết H1 tương ứng (bảng 2). Việc so sánh này sẽ cho ra giá trị P, là tỉ lệ giữa số lượng giá trị Fis giả lập ≥ giá trị Fis quan sát, cung cấp một ước lượng không chệch cho xác suất đúng của giả thiết H0. Nếu giá trị P < α, ta bác bỏ giả thiết H0 chấp nhận đối thiết H1: giá trị Fis quan sát ≠ 0 có ý nghĩa thống kê tại mức ý nghĩa α, và quần thể không cân bằng Hardy - Weinberg.
Nếu giá trị P ≥ α, ta chấp nhận giả thiết H0: giá trị Fis quan sát khác 0 do sai số ngẫu nhiên, và quần thể ở trạng thái cân bằng Hardy-Weinberg ở mức ý nghĩa α. Các giá trị Fst trong thực tế hầu hết đều > 0, và ta cần phải xác định ý nghĩa thống kê của sự lớn hơn đó bằng việc đặt ra và kiểm định giả thiết H0 và đối thiết H1 tương ứng (bảng 3). Fst (Tiên Yên-. Tò) > 0 do sai số ngẫu nhiên Fst(Tiên Yên-Tò) > 0 có ý nghĩa thống kê Phần mềm genetix tạo một quần thể ảo bằng cách hoán vị các kiểu gen dựa theo tần số các kiểu gen quan sát được giữa các cặp quần thể gà với nhau.
Tỉ lệ các Fst ảo ≥ Fst quan sát sẽ cung cấp một ước lượng không chệch cho xác suất đúng của giả thiết H0 tại mức ý nghĩa α. Hầu hết giá trị DS giữa các quần thể trong tự nhiên thu được đều > 0, và ta cần phải xác định ý nghĩa thống kê của sự lớn hơn đó bằng việc đặt ra và kiểm định giả thiết H0 và đối thiết H1 tương ứng (bảng 4). Và ngược lại, nếu tỉ lệ so sánh này cao hơn hoặc bằng mức ý nghĩa α, ta chấp nhận giả thiết H0, bác bỏ đối thiết H1.
Việc vẽ cây quan hệ di truyền được thực hiện theo quy trình sau: phần mềm MSA tiến hành 1000 lần bootstrap tạo ra 1000 ma trận giá trị DS tính theo Nei [27];.
